HPLC-SOP程序.docx

戴安HPLC标准操作规程（SOP） 一、开机 打开仪器各部分后面板电源线下方的电源开关，仪器将开机自动进行自检。自检成功后，打开电脑，双击电脑右下角的变色龙软件服务检测器（Chromeleon server monitor）,左键单机启动，激活检测器。双击变色龙图标，进入U3000仪器控制面板进行常规操作。二、准备工作泵：流动相：①、流动相是否充足：（主要是有机相或者是单一通道的缓冲盐体系）一般应在所预计的消耗量之上加150mL，以保证仪器运行过程中不会出现流动相短缺；②、流动相是否新鲜：（主要是高纯水及缓冲盐流动相），一般情况下一次制得的纯水或缓冲盐流动相应在连续的24小时内使用完。B、柱塞清洗液：清洗液是否新鲜及匹配：对于常规的流动相（一般指不含盐或者离子对等添加剂的流动相），配制50%甲醇作为清洗液。对于含盐或者其他添加剂的流动相，配制5%甲醇或高纯水作为保存液。若长时间不用，则改为50%甲醇作为保存液，并在下次使用根据所使用的流动相配制使用的清洗液。C、溶剂管道:为防止管路中的气泡对色谱柱、泵和检测器产生不同程度的影响，若泵长期不用，或者更换流动相时，都应该打开PURGE阀进行流动相自动脱气，完成后关闭PURGE再启动泵流速。自动进样器：进样针清洗：当连续使用中需要更换样品类型或流动相粘度较大时，应在每次进样完成后进行针清洗。柱温箱：柱温箱应在打开电源且柱连接好后，及时设置为方法要求的温度。检测器：为减少灯能量浪费，检测器应在样品准备完成后或基本完成时，且仪器体系按要求的流动相及流速平衡至少30min以上后打开，在完成自检20min以后方可开始样品的分析。三、仪器平衡泵：应以完成准备工作后，以0.2mL/min的步进速度进行流速的增加，在达到0.6mL/min以上的流速时，进行等度流动相比例或梯度流动相初始比例调整，待压力稳定后，平衡30min以上时间，方可进样分析。当比例调整幅度大于40%的变化时，应进行过渡（选择两步或两步以上调整后达到需要的比例）检测器：常规情况，设定方法要求的波长并调整检测器显示范围为-5~100mV，查看基线20min以上，基线基本平直即可开始进样分析。柱温箱：在方法要求使用柱温箱时，应在仪器电源打开后，及时将柱温箱温度设置到预定值并启动。进样器：手动进样在系统平衡过程中，应该扳至Inject位置，以保证系统充分平衡。四、样品方法的编辑与运行五、数据分析选择一个sequence打开单针色谱图，在仪器控制界面选择“Data processing Home”,在“Processing Method”里找到“Detection”,设定积分方法。在“Peak Result”中查看相应的积分结果。六、关机关机：样品分析完成后，应首先关闭检测器的灯，以减少灯能量的损失；其次，根据流动相的组成，选择纯甲醇或在5%甲醇水溶液除盐后以纯甲醇进行清洗（连续使用情况下，每日至少清洗30min以上的时间非连续使用应增长清洗时间，具体以相关的样品为参考；含盐流动相至少以5%的甲醇水溶液清洗45min以上后，逐步改为纯甲醇清洗）；完成上述操作后再将柱温箱关闭或降至室温。关闭仪器各部件上的电源开关,并闭电脑七、注意事项1、 流动相冲洗用的水，必须是重蒸水或2 次蒸馏水，并用微孔滤膜过滤，而且要定期更换，防止长细菌堵塞仪器管路。建议每周至少更换两次。2、 操作有机溶剂时一律戴一次性手套。3、 流动相中有盐或酸时，在流动相冲洗前后一定要用水冲洗流路，防止柱效下降、堵塞或柱塌陷。4、 仪器使用前后一定要用甲醇或乙腈冲洗流路，平衡色谱柱，赶走管路中的杂质和水分。5、 流动相禁止使用氯仿、三氯（代）苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、酮、甲基环己胺等，以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。6、 仪器长期不用时，应用甲醇冲洗各流路。7、 检测器的紫外或可见灯在开的情况下，一定要保证有液相流经检测池。若不需要做样，可设置一个较低的流速（如0.1ml/min）。一次开灯相当于30h灯寿命，因此建议尽可能将样品集中分析；遇有样品分散的情况，且间隔不超过8h，建议不要关灯。仪器运行过程中，尽量避免在仪器上使用USB设备。软件运行过程中，不可将加密狗拔下样品数据应定期进行备份，以减少系统问题造成的数据安全隐患。八、常见问题分析不出峰A、错误的流动相：条件检测器显示的基线噪音是否正常？如果检测器的输出只是一条直线，可能检测器或数据传输不正常。去掉色谱柱进已知样品检查检测器的响应是否正常。B、没有进样，或进样量不足：确保样品被注入定量环，检查进样已经发生（进样后会有压力波动）。C、过高的背景电流/噪音（CAD）：检查流动相的质量，具体见基线部分。D、样品容易挥发（CAD）：查看分析物的蒸气压峰拖尾A、样品与硅烷官能团反