血管瘤干细胞联合雌激素构建血管瘤裸鼠模型及其机制的研究.docVIP

　　血管瘤干细胞联合雌激素构建血管瘤裸鼠模型及其机制的研究 --绪 论 与血管畸形不同的是，血管瘤具有其独特的临床表现，通常在 1 岁以内的 1～2 个月及 4～5 个月快速增殖，随后进入持续数年的消退期，约 50%的病灶可在 5 岁前自行消退，70%的病灶可在 7 岁前自行消退[2]，但高达 40％的患者会遗留皮肤瘢痕、皮下毛细血管扩张、纤维脂肪块等，也有少数巨大或位于关键部位的血管瘤可继发严重并发症，例如溃疡、感染、出血、心功能衰竭等，影响外形、功能甚至危及生命，必须早期进行干预治疗。目前，针对增殖期血管瘤的治疗方法有多种，疗效不一，且缺乏可预测性。浅表血管瘤可采用噻吗洛尔滴眼液、咪喹莫特软膏局涂，单纯激光或激光联合药物治疗；深部血管瘤首选口服普萘洛尔，也可联合或单独应用糖皮质激素、瘤内注射激素、平阳霉素治疗等；多发性血管瘤、巨大血管瘤或生长快速的血管瘤首选口服普萘洛尔治疗，如效果不佳，可配合口服糖皮质激素，或皮下注射 干扰素，甚至可采用静滴细胞毒药物长春新碱等治疗。血管瘤消退期的残存病变，可选择激光治疗、手术切除或修整。2008 年，法国儿科医师偶然发现普萘洛尔可有效控制血管瘤增殖[3]，随后有大量文献报道了其显著的疗效和较少的副作用[4-5]，普萘洛尔现已逐渐取代糖皮质激素而成为婴幼儿血管瘤的一线治疗药物[6]，但停药过早容易复发，文献报道的治疗方案（每天 1 次、2 次或 3 次）、用药剂量（1～3mg/kg）及疗程（4～10 个月）等很不一致，疗效和用药安全性等也需进一步研究和确定。最近的研究[7]发现，雷帕霉素（一种 mTOR 抑制剂）能够抑制血管瘤干细胞在体内自我更新、分化和形成血管的能力，有望成为治疗血管瘤的新药。 目前，影响血管瘤治疗效果进一步提高的主要原因是对血管瘤的病因和发病机制了解不够以及缺乏理想的血管瘤动物模型。增殖早期血管瘤的组织病理特点为大量快速分裂增殖的幼稚内皮细胞团块，没有明显的管腔；进入消退期，肿瘤细胞开始凋亡，由内皮细胞和周细胞构成的紊乱血管管腔开始增多，随后肥大细胞和成纤维细胞增多，血管管腔增大，基底膜增厚；在消退后期，肿瘤组织最终被结缔组织和脂肪组织所代替。血管瘤的确切发病机制目前仍不十分清楚。已知早产、胎盘前置、出生时低体重、孕期行绒毛膜活检等都是血管瘤的诱发因素，增殖期血管瘤患儿血清中的血管内皮细胞生长因子（VEGF）和尿液中FGF2较正常婴幼儿表达升高[8-10]；还有研究发现，VEGFR2/KDR等基因突变在血管瘤的发病过程中扮演着重要角色[11]。随着肿瘤干细胞研究的快速发展，血管瘤干细胞已成为血管瘤发生、发展研究的热点。以往的研究发现，胎盘细胞和血管内皮祖细胞(EPC)有着惊人的相似之处[12]。体外培养过程中，血管瘤组织中分离的内皮细胞与正常组织的内皮细胞相比，具有体外克隆形成、快速增殖和迁移能力,能够促进血管瘤内皮祖细胞的迁移活动[13]。EPC存在于增殖期血管瘤组织中，但却不存在于消退期血管瘤组织中。增殖期血管瘤患儿外周血循环中的EPC水平较同龄健康婴幼儿升高约15倍。2008年，Khan等[14]通过CD133免疫磁珠分选方法从增殖期血管瘤组织中分选出能够形成单细胞克隆，并且具有旺盛增殖传代能力的血管瘤干细胞(HemSC)，这种细胞能够向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、神经胶质细胞等多向分化，植入裸鼠后，能在裸鼠体内形成具有新生血管的类组织块，免疫组织化学证实表达血管瘤特异性标记葡萄糖转运蛋白1(Glut-1)。随着时间的推移，血管成分减少而脂肪组织增加，重现了血管瘤的发病过程。最近的研究[15]发现，HemSC向血管内皮细胞分化是通过血管内皮生长因子VEGFA、VEGF-B与VEGFR-1结合后调节细胞外蛋白激酶ERK1/2磷酸化而诱导实现的，如果封闭ERK1/2信号通路或下调VEGFR-1表达，则能阻止干细胞向血管内皮细胞分化，抑制体内的血管生成。将血管瘤干细胞与血管内皮祖细胞混合植入裸鼠皮下后，新生血管的数量显著增加。 ………. 第一部分 脐静脉内皮细胞及血管瘤干细胞的分离、培养和鉴定 1.材料 1.1 主要实验设备 (1) 水平层流超净工作台（Laminar floo Forma Class100 型，Thermo Fisher Scientific公司，美国。 (3) 恒温振荡培养箱：THZ-98A 型，上海一恒科学仪器有限公司，中国。 (4) 普通台式离心机：Thermo公司，美国。 (5) 低温高速台式离心机：Allegra X-12R Centrifuge，Beckman 公司，美国。 (6) 精密天平：Mettler Toledo 公司，瑞士。 (7) 电热恒温水浴箱：DKZ系列，上海一恒科技有限公司。 (8) 倒置相差荧光显微镜：N