DNA溶解度问题.docVIP

乙醇沉淀法是一种常用的技术集中的盐在水溶液中的核酸（DNA或RNA）准备。 其基本做法是，加入盐和乙醇水溶液，这迫使核酸沉淀出的解决方案。 然后可以休息的解决方案，通过离心分离沉淀核酸。 在寒冷的70％乙醇洗涤沉淀，然后再经过离心步骤乙醇被删除，并允许核酸颗粒干燥，然后在干净的缓冲溶液中悬浮。 那么如何工作的呢？ 关于溶解度的位... 首先，我们需要知道为什么核酸是易溶于水。 水是极性分子 - 它有一个部分负电荷的氧原子附近，由于共用电子对，部分正电荷的氢原子（见右图）附近。 极性分子，如DNA或RNA，因为这些费用，可以与水分子的静电相互作用，使他们能够很容易溶解于水。 极性分子，因此可以被描述为亲水性和非极性分子，不能轻易与水分子相互作用，疏水。 核酸是亲水性由于带负电荷的磷（PO3-）组沿糖磷酸骨架。 盐的作用... 好吧，这样的协议。 盐在协议中的作用是消除糖磷酸骨架上的收费。 一种常用的盐是醋酸钠。 在溶液中，分解成Na +和[醋酸 - 醋酸钠。 带正电的钠离子中和负电荷的核酸PO3组，分子远低于亲水性，因此多不溶于水。 乙醇的作用... 钠离子在溶液中和PO3-离子之间的静电吸引力， HYPERLINK /translate_c?hl=zh-CNlangpair=en%7Czh-CNrurl=.hku=/wiki/Coulombs_lawusg=ALkJrhiefSxHF-B3JhtpETmBn6bVOhH2UA \t _blank 库仑定律 ，这是解决方案的电介质常数的影响决定。 水具有较高的介电常数，这使得它相当困难Na +和PO3-走到一起。 另一方面乙醇低得多的介电常数，使得它的Na +更容易互动，PO3-，它的电荷屏蔽，使核酸的亲水性，使其下降了解决方案。 温度的作用... 作为必要的协议，在协议中普遍提及的核酸/盐/乙醇的混合物在低温（如-20或-80C）的孵化。 然而，根据，曼尼阿蒂斯等 （分子克隆实验手册第二版...第二版- ？！我需要得到一个新的版本），这是不是必需的，因为20ng/mL低浓度核酸沉淀在0-4C，所以在冰上潜伏期为15-30分钟就足够了。 用70％乙醇洗涤步骤... 这一步是洗任何剩余的盐颗粒的DNA。 核酸沉淀的一些技巧... 盐的选择 使用常规的DNA沉淀醋酸钠 （0.3M终浓度，pH值5.2） 使用DNA含有SDS自氯化钠保持SDS在70％乙醇中易溶，所以它不会沉淀的DNA样本， 氯化钠 （0,2米决赛浓度）。 使用氯化锂 （0.8M终浓度）的RNA。 这是因为2.5-3乙醇卷应该被用于RNA沉淀和LiCl是比乙酸钠溶于乙醇，所以不会沉淀，但要小心 - 氯离子会抑制蛋白质的合成和DNA聚合酶，使氯化锂的RNA PREPS没有好的在体外翻译或反转录。 在这种情况下，使用醋酸钠。 用于去除dNTPs浓度的醋酸铵 （2M终浓度），但不使用T4聚核苷酸激酶反应制备的DNA铵离子抑制酶。 在低浓度或小核酸件（少于100个核苷酸）的降水以增加产量 氯化镁的终浓度为0.01M 潜伏期冰离心前的时间增加至1小时。 酚/氯仿抽提 和乙醇沉淀 描述 酚/氯仿抽提 最常用的和有益的，从水溶液中的DNA和RNA的分离和浓度的方法之一是酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。 在有机萃取，蛋白质污染物变性和分区与有机相或有机相和水相之间的界面，而留在水相中的核酸。 在这个协议中使用的苯酚缓冲，以防止破坏核酸在苯酚氧化的产品。 要知道，酚可引起严重的化学烧伤，皮肤上，会损伤衣物。 与苯酚工作时戴手套，安全眼镜，实验室大衣。 建议在这里提出的方法，酚/氯仿（50％/ 50％V / V） 提取 。 在大多数情况下，这种混合物提供 良好的蛋白质变性和水相和有机相之间的更紧密相间。 提取过程中过多的泡沫如果有一个问题，异戊醇可以增加获得的酚/氯仿（50％/ 49％）/异戊醇（％）的有机组成。 传统的乙醇沉淀 在乙醇沉淀，盐和其他溶质，如残余苯酚和氯仿溶液中保持，而核酸形成白色沉淀物，可以很容易地通过离心收集。 如果水的体积小于450 PL，反应可在离心管中。 这是最方便的格式进行有机提取物和乙醇沉淀。 对于体积较大，可以使用多种离心管，可以扩展或反应。 当缩放的反应了，使用的酚/氯仿提取，并离心机盖紧聚丙烯管在2500在室温下转速来解决阶段聚苯乙烯管能不能承受的酚/氯仿乙醇沉淀可以将在15个执行- 。。或30 -毫升的Corex管，沉淀15分钟，在4℃离心收集10,000 XG。 据建议，Corex公司管是使用在 50％硝酸浸泡在蒸馏水彻底清洗，高压灭菌20分钟，1小时前洗酸。 在我们的手，核酸片段和寡核苷酸超过15个核苷酸可以有效地沉淀，使用此协