牛IL18成熟蛋白基因的表达及生物学活性测定.ppt

牛白介素-18成熟蛋白基因表达及生物学活性测定 山东农业大学 田兆菊 指 导 教 师 赵宏坤 教授 汇报内容 牛白介素18研究的目的意义 研究现状 试验一 BoIL-18在大肠杆菌中的表达及 生物学活性测定 试验二 BoIL-18在昆虫杆状病毒表达载体 中的表达及生物学活性测定  研究的目的意义（一） 细胞因子(cytokines)是强有力的蛋白性调节因子,可以调节免疫反应、炎症反应、组织修复、组织移植和造血等。 近年来，重组细胞因子已在一些动物疾病预防、免疫治疗和构建新一代基因工程苗等方面显示出了广阔的应用前景  白细胞介素18（ Interleukin-18 , IL-18）是近年发现的一种多功能免疫调节蛋白,它在先天及后天的免疫应答调节中起重要作用。 研究表明,IL-18能诱导产生IFN-γ。人类医学研究已经证明了IL-18在抗微生物感染,尤其是在抗肿瘤免疫方面具有潜在的应用价值。 研究的目的意义（二） 研 究 现 状 牛白细胞介素18（ Bovine Interleukin-18 , BoIL-18）的研究相对滞后，1999年, shoda等首次获得了BoIL-18基因。 目前，国内对BoIL-18的研究还属于起步阶段, 但不容否认的是，BoIL-18的基因及其编码蛋白在免疫学研究以及奶牛疾病防治中具有重要意义, 有望成为一种新型生物制剂。 试 验 一 BoIL-18基因在原核表达载体中的表达及生物学活性测定 pMDT-BoIL18 PCR扩增 双酶切 pGEX6p-1 BL21中表达 pGEX-BoIL-18 纯化 双酶切 BoIL-18基因片段 线性pGEX6p-1 GST-BoIL18 连接 酶切、PCR及测序鉴定 技 术 路 线 检测生物学活性 对PBMC的增殖 促进IFN-γ产生  制备牛PBMC，接种于96孔细胞培养板 分组 空白组 RPMI 1640 对照组 Con A BoIL-18组：不同浓度 GST组：不同浓度 培养 MTT 培养 DMSO 读取OD570值 结果及分析 PI SPSS软件 BoIL-18融合蛋白的生物学活性测定（一） BoIL-18融合蛋白对PBMC的增殖实验  用双抗体夹心ELISA法测定 制备脾淋巴细胞，接种于细胞培养板 分组 空白组 RPMI1640 阴性对照组 不同浓度的GST蛋白 BoIL-18蛋白组 不同浓度的BoIL-18融合蛋白 培养 取培养上清检测ELISA抗体 结果判定 OD450值 P/N≥2.1为阳性 BoIL-18融合蛋白的生物学活性测定（二） BoIL-18融合蛋白促进IFN-γ的产生 结 果（一） 重组表达质粒的鉴定 重组质粒的双酶切及PCR鉴定结果 1，2： pGEX6p-1-BoIL-18 经 Sal I、Not I 双酶切 3：PGEX6P-1的空载体经Sal I、 Not I 双酶切 4：DL2000 marker 5：pGEX6p-1-BoIL-18的PCR 扩增 6：PGEX6p-1的PCR扩增 结 果（二） DNA测序 TCCCCGGAATTCCCGGGTCGACCAGATTATACCATGGATCACTTTGGCAAACTTGAACCTAAGCTCTCAATCATACGAAATCTGAACGACCAAGTTCTCTTCATTAGCCAGGGAAATCAACCTGTCTTTGAGGATATGCCTGATTCTGACTGTTCAGATAATGCACCCCAGACCATATTTATCATATATATGTATAAGGACAGCCTCACTAGAGGTCTGGCTGTAACCATCTCTGTGCAGTGTAAGAAAATGTCTACTCTCTCCTGTGAGAACAAAATTATTTCCTTTAAGGAAATGAATCCTCCTGATAACATTGATAATGAAGGAAGTGACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTTCCAGGACATGATGATAAGATACAATTTGAGTCTTCATTGTACAAAGGGTACTTTCTAGCTT