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生物化学检验中酶的测定 广州医学院医学检验系 临床生化教研室 前言 酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类。绝对定量法是通过特异试剂与酶作用直接测定酶蛋白量或酶分子浓度的方法。相对定量法是根据酶的催化活性或酶促反应速度来间接测定酶浓度的方法。目前临床上所用的方法多属相对定量法。 本节内容 一、酶活性浓度的测定 二、酶质量浓度的测定 三、同工酶及其亚型测定 四、酶活性浓度测定的主要影响因素及控制 酶活性浓度的测定 主要内容 酶活性浓度测定的基本原理 酶活性浓度的测定方法 底物或产物浓度的检测 酶偶联反应法 工具酶与共通反应途径 酶活性浓度的单位 酶活性浓度测定的基本原理 酶催化活性的途径 酶催化活性可通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得。 用这种方法获得的酶浓度的确切名称是“酶的催化活性浓度”或简称为“酶活性浓度”。 酶活性与反应速率的关系 若[S]Km，且[S]很大，米-曼氏方程式可简化为： 此时，酶促反应的最大速度只与酶催化活性或酶量[E]成正比例， 它是建立准确、可靠测定方法的基础。 酶促反应过程的分期 一个典型的酶促反应过程一般包括三个阶段。 延滞期（lag phase）、 线性期（linear phase） 非线性期（non linear phase） 酶促反应时间进程曲线 注意事项 要准确测定酶活性，必须了解不同酶反应速率和时间的关系， 找出酶促反应速率恒定的时间， 避开延滞期、非线性反应期。 传统的手工分析法无法在零级反应期测定，故结果不够准确。 酶活性浓度的测定方法 酶活性浓度的测定方法 以反应时间为依据，酶活性浓度测定方法可分为两大类 定时法（fixed time assay） 连续监测法（continuous monitoring assay） 定时法 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 定时法中酶促反应的过程 注意事项 用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进行测定， 避开延滞期和一级反应。 连续监测法 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。 连续监测法的测定时间 注意事项 自动生化分析仪能自动获取规定时间内的信号，自动判断非线性度，所以连续监测法更适合于自动化仪器。 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。 底物或产物浓度的检测 底物或产物浓度的检测 在酶活性测定方法中，无论是定时法还是连续监测法，酶促反应速度都要通过测定底物或产物来实现。 依据酶促反应中底物或产物的理化特性质及检测方法，酶活性浓度测定的方法可分为直接法和间接法。 直接法 这类方法是在不终止酶促反应条件下，通过特殊的仪器直接测定反应体系中底物或产物的理化特性变化量， 如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等，从而计算出酶活性浓度的方法。 基于NADH或NADPH理化特性的测定方法 利用NAD(P)H在340nm处的吸光度值的变化，测定各种脱氢酶的活性，该法是目前应用最广的一类方法。 基于人工合成色素原底物理化特性的测定方法 一些水解酶类或转移酶类可通过酶促反应将化合物中的某一基团水解或移去，使无颜色的底物转变为有颜色的产物。人们把这类底物称为“色素原”底物。根据这一原理，人们设计合成了一系列底物用来测定酶活性。 间接法 间接法是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物，然后进行测定的方法。 化学法 大多数是在酶促反应终止后加入另一个试剂与底物或产物反应，转化为有色化合物，再用分光光度法检测。 部分酶类是在原来反应体系中加入一些与酶促反应无关的试剂，这些试剂只和酶促反应的某一反应物迅速作用，产生可被仪器检出的有特征性物质，但同时又不和酶作用也不影响酶活性。 酶偶联法 是目前在酶活性测定中应用最多，最为广泛的方法。即在原反应体系中加入另一些酶试剂，将所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。 在临床常规酶学分析中，以NAD（P）H为辅酶或辅基的脱氢酶，以及过氧化物酶（POD）是常用的酶偶联法的酶试剂。 酶偶联反应法 酶偶联反应式 酶偶联反应法的基本原理 在酶活性测定时，如果底物或产物不能直接测定或难于准确测定，可采用酶偶联法测定，即在反应体系中加入一个或几个工具酶，将待测酶生成的某一产物转化为新的可直接测定的产物，当加入酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用指示酶的反