油菜下胚轴转化.docxVIP

油菜下胚轴暗光培养转化一、步骤流程1.灭菌（1）75%酒精浸泡种子1min，时间不能过长。（2）将浸泡过的种子倒入无菌培养盒中，用无菌水冲洗一遍，加入适量的消毒液HgCl2，灭菌15min，对污染较重的种子，灭菌时间可延长到20min。（3）消毒后，用无菌水冲洗种子4-5遍。注意：HgCl2浓度：0.1%-0.2%，用实验室5%的母液稀释即可，用量根据所灭种子的量决定，要完全浸没种子。2.播种（1）用无菌镊子，将灭菌的种子播到M0，每皿10-12粒。（2）将培养皿放到无菌培养盒中，暗处理培养5-6天，温度24℃。3.摇菌播种4天后，用AB培养目标菌株，或者5天后用LB培养目标菌株。用无菌三角瓶或者离心管（三角瓶中加25-30ml培养液，离心管中加10-20ml培养液）于28℃，,180-220rpm摇床中。注意：摇菌前要挑取单菌落，在抗性平板上接种细菌，28℃下培养一天，如果是目标细菌就会在平板上长很多单菌落，此时用10ul枪头吸取该单菌落，再将枪头在上述培养基中反复吸打几次。4.外植体的制备与侵染（1）用无菌镊子和解剖刀切取播种6天后的幼苗的下胚轴，每个长度为0.8-1cm，在M1液体培养基中切取效果更佳，切取外植体时尽量一刀垂直切下。（2）测菌的OD值（AB中的0.3左右较好，一般需要两天，LB中0.8左右较好，一般16h即可），将培养好的菌株在离心机6000rpm(4000rpm)离心，10min。倒掉上清，用与菌液相同体积的DM重悬，再在相同条件下离心。弃上清后，再用相同体积的DM重悬，取2ml菌液，用20mlDM稀释（在灭菌的培养基皿中进行）（3）将切好的外植体放到已经配好浓度的皿中，侵染30min（时间不能长，否则外植体易死亡）。隔段时间摇晃一次，4-5次即可，侵染以每皿150-200个外植体/20ml菌液较合适。注意：可以先配菌液，等外植体全部切完后，将其一起转到配好的菌液中，此时开始计时。5.转到M1培养基中，每皿20-25个外植体，暗光24℃放置。6.2-3天后转到M2中，并转到光中培养（24℃，昼16h/夜8h）。7.三周后转到M3中，每2-3周继代一次，直至出现绿芽。8.转入M4生根，需2-4周。二、实验要点1.实验过程中，必须保证无菌操作。2.每次实验前，将所有有用物品准备充分3.制备培养基时，用量准确4.菌液浓度要合适5.每次装过带菌的物品必须灭菌消毒才能倒掉，包括用过的培养基。实验时间安排表时间步骤注意事项0-5天萌发24℃暗光0天配制DM、M0、播种准备M1、DM4-5天摇菌提前1-2天准备菌液6天菌液：DM=21:10侵染30min 转入M1中，根据浓度确定侵染时间每2ml菌液加20mlDM 暗光培养8-9天转入M2此后都在光下培养29-30天转入M3每2-3周继代一次直到长芽43-54天转入M4等根长长后，就可以转到土中栽培培养基成分M0DMM1M2M3M4Basic Medium1/2MSMSMSMSMSMSSucrose(g/L)蔗糖30.030.030.010.0Glucose(g/L)葡萄糖10.0Manitol(g/L)甘露糖18.018.0Xylose(g/L)木糖0.25MES(g/L)0.62,4-D(mg/L)1.01.0Kinetin(mg/L)激动素0.30.3反式-Zeatin(mg/L)2.0IAA0.1AS(uM)乙酰丁香酮100.0100.030STSTimentin(mg/L)300.0300.0Kanamycin(mg/L)25.025.0Agarose(g/L)6.06.06.0Basic Agar(g/L)12(2.5g/L)pH5.8-6.0灭菌前调至6.0，灭后pH降低5.85.85.85.85.8MS:4.4g/L300mL M0: MS 0.66g, BA 0.75g400mL DM: MS 1.76g, Sucrose 12g AS 60uL(灭菌后加)200mL M1(液体): MS 0.88g, Sucrose 6g, Mannitol 3.6g, 2,4-D 200uL, KT 60uL, AS 30uL(灭菌后加)400mL M1(固体): MS 1.76g, Agar 2.4g, Sucrose 12g, Mannitol 7.2g, 2,4-D 400uL, KT 120uL, AS 60uLM0:200mL1/2MS0.44gBA0.50gDM:200mLMS0.88gSucrose(30g/L)6gAS(100uM)200uL(灭后加)M1:400mLMS1.76gSucrose(30g/L)12gMannitol(18g/L)7.2g2,4-D(1.0mg/L)400uLKT(0.3mg/L)400uLAS(100uM)400u