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目 录 色谱法：又称色层法和层析法，是一种物理化学分离和分析方法，这种分离方法是基于物质溶解度、蒸汽压、吸附能力、立体结构或离子交换等物理化学性质的微小差异，使其在流动相和固定相之间的分配系数的不同，而当两相做相对运动时，组分在两相间进行连续多次分配，从而达到彼此分离。 1906年，俄过科学家茨维特用石油醚、碳酸钙分离叶绿素的试验被认为是色谱法最早的应用，色谱即由chroma(色彩)和graphos(图谱)构成，就是我们现在所用的chromatography(色谱)一词。 色谱的工作原理 液相色谱仪器系统 流动相的选择 在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。 正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。 反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。 流动相的选择 乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。 价格是甲醇的6~7倍。 100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水 。 截止波长乙腈190、甲醇205、正己烷210、乙醚220、四氢呋喃225、二氯甲烷245、氯仿245nm。 缓冲盐流动相注意点 (1)现配现用.低温下密封保存一般不超过3天。 (2)确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波 长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬 酸的缓冲液） (3)缓冲液必须过滤膜。 (4)使用缓冲液期间，用注射器推纯水，清洗柱塞 杆，延长泵密封垫寿命。 (5)工作完毕后及时冲洗LC系统内的缓冲液。 (6)梯度洗脱时,确认不同比列的缓冲液与有机溶剂 能互溶。 流动相的过滤和脱气 流动相的过滤 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸， 不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂 脱气的目的 1. 防止由气泡的产生引起的故障 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 2. 防止由溶解（在液体中的）气体量的变动引起的检测不稳定程度 1）示差折射率检测器*使折射率变化 2）UV检测器（200nm以下） *溶解氧气有吸收 3）荧光检测器*溶解氧气有消光作用 脱气的方法 1. 减压吸气脱气法 *可以抑制配制流动相时产生的气泡 *只是暂时的脱气法 *不能解决因溶解气体造成的问题 2. He清除法 3. 使用氟树脂膜的减压脱气法 4. 超声波脱气法 He清除法 使用氟树脂膜的减压脱气法 液相系统流程图 梯度洗脱装置 高压梯度洗脱 泵单元 进样系统 手动进样器 自动进样器 六通阀进样方式： 部分装液法：进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。 完全装液法：进样量应不小于定量环体积的5~10倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。 注意事项： ①样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。 ②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。 ③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应阀清洗接头和注射器冲洗进样阀，防止交叉污染。 自动进样器 注意事项： 样品瓶中应有超过瓶高1/3的样品量 样品瓶中样品不要装太满，应留有一定的空气。 使用与仪器配套的样品瓶。 色谱柱 色谱柱的分类： 色谱柱按用途可分为分析型和制备型 尺寸规格： ①常规分析柱（常量柱），内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10~30cm； ②窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn），内径1~2mm，柱长10~20cm； ③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm ④半制备柱，内径＞5mm； ⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm； C18硅胶填料结构 高效液相色谱检测器 荧光检测器使用注意事项 电化学检测器L-ECD-6