1-050518-HIV检测操作规程1-生物梅里埃.doc

固相酶联免疫吸附试验（ELISA）（初筛试验） ——适用于Vironostika Uni-Form Ⅱ plus O Microelisa System试剂盒 人类免疫缺陷病毒（HIV）是获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的致病病原体，HIV可以通过血液、性接触和母婴传播，AIDS是HIV攻击免疫系统而导致的一种严重综合症，其特征是易患机会性感染、肿瘤，其临床表现多种多样。 初筛用的HIV抗体酶联免疫吸附试验检测试剂必须是HIV－1/2混合型，经卫生部批准或注册，经过批批检，并在有效期内使用。以Vironostika Uni-Form Ⅱ plus O Microelisa System试剂盒为例 一、实验原理： Vironostika Uni-Form Ⅱ plus O Microelisa System是基于一步“夹心法”原理的ELISA试剂，定性检验人血清或血浆中的人体免疫缺陷病毒1型（Anti-HIV-1）和（或）2型抗体（Anti-HIV-2），及Anti-HIV-1中的O亚型，用于体外诊断。在微孔板的孔壁上包被着HIV抗原混合物：HIV-1 P24，HIV-1 GP160，HIV-1 ANT70合成肽和HIV-2合成肽，每个微板孔内放置一个由HRP标记相应抗原的球状复合物。首先加入到微板孔内的标本稀释液会溶化球状抗原复合物，然后，加入实验标本或适量的含有HIV-1，HIV-2或HIV-1 O亚型的阳性对照，进行温育。如果存在HIV-1，HIV-2或HIV-1 O亚型抗体，就会形成一个“固相HIV抗原－HIV抗体－酶标记抗原复合物”，随后进行洗板和TMB底物温育，加入H2SO4终止反应，如果标本中含有HIV-1、HIV-2、HIV-1 O亚型的抗体，将有明显颜色变化， 有颜色变化的微板孔将变为黄色，当标本中没有HIV抗体时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化。 二、试剂盒内包含物： 192人/份盒 576人/份盒 2 6 微量酶标板 每板12条，每条8孔包被有HIV-1 P24、HIV-1 GP160、HIV-1 ANT70和HIV-2env。每孔有珍珠样冻于HRP标记HIV-1 P24、HIV-1 GP160、HIV-1 ANT70和HIV-2 env酶复合物。由粘膜粘盖板条，装予箔袋内 1×2ml 2×2ml 阴性对照 不含有HIV抗体的人血清,含有防腐剂，可以即时使用 1×2ml 1×2ml HIV-1阳性对照 含单克隆HIV-1抗体的人血清,含有防腐剂,可以即时使用 1×2ml 1×2ml HIV-2阳性对照 含单克隆HIV-2抗体的人血清,含有防腐剂,可以即时使用 1×28ml 3×28ml 标本稀释液 包含蛋白稳定剂，有清洁剂和防腐剂，可以即时使用 1×100ml 1×100ml 浓缩磷酸盐缓冲液 按要求用蒸馏水或去离子水进行25倍稀释 2×11ml 4×11ml TMB溶液 四甲基联苯氨溶于柠檬酸中，按要求与尿素过氧化物溶液混合（使用时临时配制） 2×11ml 4×11ml 尿过氧化物溶液 有防腐剂、按要求与TMB溶液混合 1 1 封圈和封条 用于箔袋密封 7 7 微板封膜 有黏性 三、其他所需物品和仪器： （新鲜的）蒸馏水或去离子水 1M硫酸（分析纯） 一次性∨型水槽 一次性瓶（玻璃或塑料）用于准备TMB底物液 一次性手套 计时器 5％次氯酸钠或其他经认可的消毒液 适于盛装有可能受污染物品的容器 吸水纸 加样器（50μl、100μl、1ml）准确度±2％及一次性加样头 微板振荡器，用于溶解及混合结合物与样品，转速约900转/分 水浴箱37±2℃ 酶标仪（BIO-RAD 550），单波长450±5nm或双波长450±5nm和620-700nm作为参考，具体操作步骤参见“酶标仪操作标准程序” 洗板机（BIO-RAD 1575），具体操作步骤参见“洗板机操作标准程序” 四、标本的收集和准备： 标本的收集详见“标本的采集及处理制度” 血清、血浆都可以使用，柠檬酸、肝素钠和EDTA等抗凝剂对检测结果不会产生影响，但不能与其他药物并用 标本中若含叠氮钠或微粒物质对检测结果会产生影响 高胆红素血、高溶血，乳蘼血或高蛋白血标本通常不会影响实验结果 标本中应无微生物，在2～8℃温度下，可贮存一周，新鲜标本可长期贮存在-20℃（或以下） 经一个冷冻/溶化周期处理或在56℃30分钟的热失活标本不会影响实验结果 五、试剂准备 1、在开始实验之前标本和试剂应处于室温（18～25℃），不同批号不得混用，实验应在室温下进行，使用后