分子量(还原型SDS-PAGE)测定标准操作规程.docVIP

细胞因子分子量（还原型SDS）测定标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于细胞因子蛋白质分子量测定。 目的：测定待检品分子量是否符合《中华人民共和国药典》2005年版要求 原理： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子凝胶后再进行电泳。因此它兼具了分子筛效应与电泳效应。其催化系统为过硫酸铵-TEMED系统。而SDS这种阴离子表面活性剂的加入，它能使蛋白质氢键、疏水键打开，并按一定比例与蛋白质分子结合成带负电的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳的迁移率只取决于分子量大小这一因素，从而达到分离不同组分的蛋白质的目的，并在还原剂巯基乙醇的存在下，（定量的巯基乙醇可以使蛋白质分子内的二硫键彻底还原；以使SDS定量的结合到蛋白质分子上去，使蛋白质具有相同的构象），可以检测到是否有蛋白质聚合体的产生。 内容： 材料 1．1样品：经二人复核批号无误后检测 1．2试剂 甲醇 CH3OH 分析纯 无水乙醇 C2H5OH 分析纯 浓盐酸 HCl 分析纯 甘油 C3H8O3 分析纯 硝酸银 AgNO3 分析纯 重铬酸钾 K2Cr2O7 分析纯 正丁醇 C4H9OH 分析纯 甲醛 HCHO 分析纯 丙烯酰胺 CH2CHCONH2 分析纯 甲叉双丙烯酰胺 [（CH2CHCONH2）2]CH2 分析纯 过硫酸铵 （NH4）2S2O8 分析纯 TEMED（四甲基乙二胺）(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2 分析纯 甘氨酸 C2H5NO2 分析纯 SDS（十二烷基硫酸钠）C12H25O4SNa 分析纯 乙酸 CH3COOH 分析纯 碳酸钠 Na2CO3 分析纯 β-巯基乙醇 HSCH2CH2OH 分析纯 溴酚蓝 C19H10Br4O5S 分析纯 1．3分子量标准品：法玛西亚公司。 1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求 1．5设备 扭力天平 上海第二天平仪器厂 垂直板状电泳槽 北京东方仪器厂 恒温恒流电泳仪 法玛西亚公司 快速电泳槽 BIORAD USA 全自动扫描仪 CS-930 日本岛津 TS-1型摇床 1．6器皿：500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管、3000ml三角瓶、平皿、1000ml烧杯、80ml烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。 2 方法 2．1准备工作 2．1．1工作环境：控制区，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。 2．1．2调试仪器设备 2．1．2．1恒温恒流电泳仪工作状态良好，已经挂“备用”标志牌。 2．1．2．2全自动扫描仪工作状态良好，已挂“备用”标志牌。 2．1．2．3扭力天平工作状态良好，已挂“备用”标志牌。 2．1．3摘下扭力天平“备用”标志牌，挂“运行”标志牌。 2．1．4配液：以下溶液的配制完成后，均需经二人复核无误后，在瓶外贴标签，注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期。 2．1．4．1聚丙烯酰胺凝胶母液 100ml 用扭力天平准确称取丙烯酰胺30g, 甲叉双丙烯酰胺0.8g，加50ml注射用水溶解后定容至100ml，过滤，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。一般不超过1～2个月。 2．1．4．2分离胶缓冲液 100ml 用扭力天平准确称取Tris18.15g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调节pH8.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。 2．1．4．3浓缩胶缓冲液 100ml 用扭力天平准确称取Tris6.05g，溶