核酸分子杂交技术手册 - 上海闪晶分子生物科技有限公司.pdf

核酸分子杂交技术 一、 概述 前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键 （主要是氢 键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链 的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序 （即某种程 度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在 DNA 与 DNA 、RNA 与 RNA 或 RNA 与 DNA 的二条单链之间进行。由于 DNA 一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链 DNA 分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高 pH 值来实现。使单链聚合双 链的过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同 位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。 核酸杂交技术基本上是 Hall 等 1961 年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平 衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。Bolton 等 1962 年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为 DNA-琼脂技术。变性 DNA 固定在琼脂中， DNA 不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。典型的反应是用放射性标记的短 DAN 或 RNA 分子与胶中 DNA 杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下 将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。该法尤其适用于过量探针的饱和杂 交实验。60 年代末，Britten 等设计了另一种分析细胞基因组的方法。该法是研究液相中 DNA 的 复性以比较不同来源核酸的复杂度，典型的方法是：从不同生物体 （细菌、酵母、鱼和哺乳动物 等）内分离DNA ，用水压器剪切成长约 450 核苷酸 （nt ）的片段。剪切的DNA 液（含 0.12mol/L 磷酸盐缓冲液或 0.18mol/l Na+ ），经煮沸使 dsDNA 热变性成 ssDNA 。然后冷至约 60℃，在此温 度孵育过程中，测定溶液一定时间内的 UV260nm 的吸光度 （减色效应）来监测互补链的复性程 度。通常该实验可比较不同来源生物 DNA 的复性速率，并可建立序列复杂度与动力学复杂度间 的关系。 60 年代中期 Nygaard 等的研究为应用标记DNA 或 RNA 探针检测固定在硝酸纤维素（NC ） 膜上的 DNA 序列奠定了基础。如 Brown 等应用这一技术评估了爪蟾 rRNA 基因的拷贝数。RNA 在代谢过程中被3H 尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定的基因组DNA 杂交，继而用RNase 处理，消化非特异性结合的 RNA 。漂洗后计数以测定杂交探针的量。通过计算与已知量 DNA 杂 交的 RNA 量即可评估 rRNA 基因数。由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异 1 热线电话：021－5446 0832 8009881995 E-mail:master@ 网址： 基因的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。 进入 70 年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如，对特异基因转录产 物的分析和对动力学杂交实验又有兴趣。固相化的 Poly U –Sepharose 和寡（dT ）-纤维素使人 们能从总 RNA 中分离Poly A+ RNA 。用mRNA 的经纯化技术可从网织红细胞总 RNA 中制备α- 和β-珠蛋白 mRNA 混合物。这些珠蛋白 mRNA 首次被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的 表达。由于制备cDNA 探针很繁琐，所获得 cDNA 的长度和纯度也不稳定。所以寻求新的探针来 源是使分子杂交技术进一步推广的基础。 70 年代末期到 80 年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶的发展和应用 使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体 DAN 载体的构建，使特异性 DNA 探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA 文库和 cDNA 文库中获得特定基因克隆， 只需培养细菌，便可提取大量的探针 DNA 。迄今为止，已克隆和定性了许多特异DNA 探针。 由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，