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血清碱性磷酸酶活性测定 授课教师： 生物化学与分子生物学实验 CQMU 2008 实验目的 1.学习血清碱性磷酸酶活性测定 的原理及方法 2.了解血清碱性磷酸酶活性测定的临床意义 基本概念 酶活性：即酶催化化学反应的能力。 酶的活性通常以活性单位表示。 它反映在规定的条件下，酶促反应在单位时间内（秒、分或小时）生成一定量的产物（mg、μg 、μmol）或消耗一定量的底物所需的酶量。 基本概念 酶活性单位是衡量酶数量的尺度，同一种酶由于实验方法、测定条件不同，酶活性单位的规定也不同。 在相同测定条件下，酶活性单位越大，表示酶的含量越高，酶促反应速度越快。 惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 国际单位(IU) ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1?mol底物的酶量。 Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量。1Katal=60×106IU 本实验以血清在37℃，pH为10的条件下，与AKP底物液作用30min，每生成1mg酚所需的酶量为1个酶活性单位。 实验原理 碱性磷酸酶（AKP）在碱性条件下催化磷酸苯二钠水解，释放出酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色的醌类化合物。 碱性磷酸酶 磷酸苯二钠 磷酸 + 酚 + 4-氨基氨替比林 铁氰化钾 醌类化合物 实验原理 碱性磷酸酶：一组在碱性条件下水解磷酸酯键的酶类。 广泛分布在人体的骨、肾、肠、血清、胆汁等部位，以骨骼，牙齿、肾和肝中含量较多。 正常人血清中的AKP主要来源于骨骼、肝胆和肠道。 方法评价 优点：灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、快速； 缺点：准确度和精密度都较低,受胆红素和溶血的干扰。 实验材料与仪器 器材： 新鲜血清、移液器、试管及试管架、吸量管、恒温水浴箱、分光光度计 移液器 1.调刻度 2.取样 注意：加不同物质换 枪头 实验材料与仪器 试剂盒： 1.混合液：磷酸苯二钠、4-氨基安替比林 2.标准液：已知浓度的酚溶液 3.样 品：血清 4.蒸馏水 5.显色剂:高铁氰化钾 试剂 空白 标准 测定 蒸馏水（ul） 50 — — 标准液（ul） — 50 — 样 品（ul） — — 50 混合液（ml） 1 1 1 充分混匀，37℃水浴30min 显色剂（ml） 2 2 2 充分混匀，显色3min，空白调“0”，510nm比色 A 0 ？ ？ 实验步骤 注意事项 1.酶加量准确 2.水浴时间准确 结果计算 C测=A测 / A标× C标 参考范围 成人：24-92 u/L 儿童：35-140 u/L 临床意义 血清AKP测定可用于骨骼系统及肝胆系统疾病的辅助诊断。是临床常做的酶类检验项目之一。 活性升高 ——骨病、恶性肿瘤骨转移、佝偻病、骨软化、骨折愈合期、成骨细胞瘤； ——恶性肿瘤肝转移、胆道梗阻等。 活性降低（少见） ——呆小病、磷酸酶过少症、维生素C缺乏症等。