17β雌二醇对人B淋巴细胞系IM9细胞的调节作用.docVIP

　　17β雌二醇对人B淋巴细胞系IM9细胞的调节作用 ：宋向凤, 牛治国, 郭继强, 黄青松 【摘要】 　　目的: 探讨17β雌二醇（17βestradiol, E2）在体外对人B淋巴细胞系IM9细胞的调节作用。方法: MTT法检测IM9细胞的增殖; RTPCR检测IM9细胞IgG及凋亡相关基因Bcl2、Bax的表达; 流式细胞术（FCM）检测IM9细胞凋亡情况。结果: 10-6～10-4 mol/L浓度的 E2对IM9细胞增殖有明显的抑制作用, 呈现剂量依赖性, 并抑制IM9细胞免疫球蛋白IgG的分泌, FCM显示E2诱导IM9细胞凋亡, Bcl2表达降低而Bax表达增强。结论: 不同浓度的E2可通过调节Bcl2、Bax基因表达及Bcl2/Bax表达比调节B淋巴细胞增殖及其免疫球蛋白的分泌。 【关键词】 雌激素; B淋巴细胞; IM9细胞; 调节 　　早在100多年前, 临床观察就已经认识到自身免疫病发病率存在男女性别的不同, 而且妊娠对自身免疫病的发生、 发展 也有重要的影响［1］, 这使人们认识到性激素, 尤其是雌孕激素对免疫系统有重要的调节作用。研究发现在绝大多数的免疫器官组织中都能找到雌激素受体的存在［2-4］, 我们以前的研究表明, 雌激素能抑制T、B淋巴细胞增殖并诱导凋亡［5, 6］, 但其作用机制仍不清楚。本实验通过不同浓度的雌激素刺激B淋巴细胞系IM9细胞, 探讨雌激素对B淋巴细胞免疫功能的影响, 为临床雌激素替代 治疗 甚至自身免疫病治疗提供理论依据。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　IM9细胞系购自美国ATCC公司。17β雌二醇为美国Sigma公司产品。超绝UNIQ10柱总RNA抽提试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司。Annexin VFITC凋亡检测试剂盒为北京宝赛生物技术有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 MTT增殖实验 　　将生长状态良好的IM9细胞制备成1×109/L的细胞悬液, 以每孔100 μL接种于96孔板, 实验设空白组、10-6 mol/L E2组、10-5 mol/L E2组10-4 mol/L E2组。置37℃、50 mL/L CO2培养箱内培养72h, 于培养结束前4 h, 每孔加入5g/LMTT10 μL, 酶标仪上检测492 nm处的吸光度(A)值。 　　1.2.2 RTPCR扩增IgG 　　用超绝UNIQ10柱总RNA抽提试剂盒提取IM9细胞总RNA, 操作按说明书进行。RTPCR扩增IgG, 引物序列如下: 上游5′CCATGGAGTTGGGGCTGAGCTGG3′; 下游5′GGGCACCAGGGGGAAGAC3′, 产物大小为465 bp。PCR反应条件为: 95℃预变性5 min, 95℃变性1 min, 60℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 共30个循环, 最后72℃再延伸5 min。取扩增产物10 μL电泳并在紫外灯下观察。 　　1.2.3 FCM检测细胞凋亡 　　不同浓度的E2刺激IM9细胞72h后, 用Annexin VFITC凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡情况, 操作按试剂盒说明进行。 　　1.2.4 RTPCR扩增Bcl2及Bax RNA提取和逆转录同上。Bcl2及Bax引物序列如下: Bcl2: 上游5′CTGTACGGCCCCAGCATGCG3′;下游5′GCTTTGTTTCATGGTACATC3′, 产物大小为96 bp; Bax: 上游5′GGGAATTCTGGAGCTGCAGAGGATGATT3′; 下游5′GCGGATCCAAGTTGCCATCAGCAAACAT3′, 产物大小为231 bp。 PCR反应条件为: 94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 58℃或62℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 共30个循环, 最后72℃再延伸10 min。取扩增产物10 μL电泳并在紫外灯下观察。 　 　　2.2 不同浓度E2对IM9细胞IgG产生的影响 　　与对照组比较, 不同浓度的E2（10-6～10-4 mol/L）均明显抑制IM9细胞免疫球蛋白IgG的产生, 也呈现剂量依赖性（图2）。 　　2.3 不同浓度E2对IM9细胞凋亡的影响 　　不同浓度的E2 (10-6～10-4 mol/L)刺激IM9细胞在72后FCM检测可见E2刺激组细胞凋亡率明显增加（图3）, 凋亡率依次为对照组（5.21±0.28）%, 10-6 mol/L E2组（14.35±0.67）%、 10-5mol/L E2组（22.21±1.09）%、 10-4 mol/L E2组（37.66±1.39）%。 　　2.4 不同浓度E2对IM9细胞凋亡相关基因Bcl2和Bax的影响 　　RT