41BBL胞膜外区蛋白对人外周血淋巴细胞体外活性的调节作用.doc

　　41BBL胞膜外区蛋白对人外周血淋巴细胞体外活性的调节作用 【关键词】 41BBL 淋巴细胞 antiCD3 antiPgp 双功能抗体 抗CD3/抗肿瘤抗原的微型双功能抗体如antiCD3/antiPgp、 antiCD3/antiCD20和antiCD3/antiCD19［1, 2］等能够将活化的淋巴细胞靶向至肿瘤细胞, 从而在体外和体内介导特异性杀伤作用, 是一种很有潜力的 治疗 恶性肿瘤的方法。但是, 采用微型双功能抗体同许多借助完全抗体的治疗相似, 也存在对肿瘤生长的控制难于持久以及停药后复发的问题。这是多种因素影响的结果, 但可以确信, 淋巴细胞作为抗肿瘤免疫过程中的主要效应细胞, 其激活程度以及活化后的状态是关键的因素之一。目前, 包括B7、 41BBL在内的共刺激分子对淋巴细胞的活化作用日益受到关注, 许多研究证明调节一种或多种共刺激分子信号能够改善效应细胞的功能并最终影响抗肿瘤免疫效果。国内外已有关于使用激活性抗41BB抗体治疗肿瘤甚至根治肿瘤的报道［3］, 但关于可溶型41BBL的作用研究很少。本室构建表达的ex41BBL在大肠杆菌16C9中表达提取纯化后, 已经对其结合活性及促进Jurkat细胞释放IL2作了相关研究［4］。本实验进一步研究其对人PBL的调节作用, 并通过体外杀伤实验研究其对antiCD3/antiPgp介导的PBL抗肿瘤活性的影响。　 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　CytoTox 96非放射性细胞毒试剂盒购自美国Promega公司; 人IL2 ELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司; 四甲基偶氮唑盐 （MTT）试剂购于博大泰克公司; 其他均为国产分析纯生化试剂。K562/A02细胞系由本室保存。AntiCD3/antiPgp微型双功能抗体和ex41BBL由本室表达和纯化。两种蛋白均带有大小为13个氨基酸的Etag作为鉴定和纯化标记, 通过Pharmarcia公司的antiEtag亲和层析柱纯化后纯度≥95%。Ex41BBL蛋白包括人41BBL的全部胞膜外结构, 其相对分子质量（Mr）约为22 000。纯化的蛋白采用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定浓度。 　　1.2 方法 　　1.2.1 淋巴细胞的分离与活化 　　健康成人全血经Ficoll分离后得到单个核细胞, 在含100 mL/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液中于37℃、 50 mL/L CO2条件下培养2 h后, 保留非贴壁的外周血淋巴细胞, 调整细胞密度为3×109/L, 加入500 μg/L antiCD3/antiPgp 和IL2 50 U/mL, 继续培养48 h后离心收集细胞, 用PBS缓冲液洗涤2次后重悬于含有100 mL/L FBS的RPMI1640培养液中用于体外实验。 　　1.2.2 细胞增殖及细胞活力检测 　　按照108/L接种淋巴细胞于96孔板, 给予如下终浓度的刺激分子, 即50 U/mL IL2、 500 μg/L anti CD3/antiPgp或二者之外再加入500 μg/L ex41BBL。分别在培养的2、 4、 6 d用台盼蓝计数检测存活细胞数量。培养第6天, 用MTT法检测各组的细胞活力。同时, 分别在培养48 h和72 h取培养液50 μL, 用CytoTox 96试剂盒检测各组上清中LDH的水平。 　　1.2.3 IL2的检测 　　将108/L 淋巴细胞接种于96孔板, 设立3个实验组, 每组3个复孔, 分别给予不同的刺激分子, 包括 500 μg/L 41BBL、 500 μg/L antiCD3/antiPgp和二者联合应用。在37℃、 50 mL/L CO2条件下培养48 h, 离心后取各组上清, 分别加入ELISA试剂盒抗体包被板条中。同时设立标准品浓度梯度组, 按照说明进行各步反应后, 测A450值, 绘制标准曲线, 计算 上清的IL2水平。 　　1.2.4 体外联合应用对K562/A02细胞的杀伤实验 采用CytoTox 96非放射性细胞毒试剂盒, 比较2种处理方法的淋巴细胞对靶细胞的杀伤效果。靶细胞K562/A02每孔加入2×104/100 μL。第1组加入500 μg/L antiCD3/antiPgp, 第2组加入500 μg/L antiCD3/antiPgp和500 μg/L ex41BBL。按照效靶比（E∶T）20∶1、 10∶1、 5∶1和2.5∶1分别加入活化的PBL, 同时按照操作说明设立对照组, 每组3复孔。在37℃、 50 mL/L CO2条件下培养4 h后, 取上清, 按照说明先后加入反应底物和终止液, 酶标仪测定A492值后