Rho A蛋白通路在DLC1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制.doc

　　Rho A蛋白通路在DLC1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制 ：吴平平, 苏昀, 金治, 吴鹏, 徐佳佳, 黄培林 【摘要】 目的： 探讨Rho A蛋白通路在DLC1(frequently deleted in liver cancer1)基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制。方法： 构建pcDNA3.1DLC1质粒载体，脂质体法转染HT29细胞，筛选稳定细胞系; pulldoa公司;原核细胞表达载体pCMVSPORT6(Amp抗 　　性)购自RZPD公司;Trizol细胞裂解液、脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;plasmid Midi Kit 购自QIAGEN公司;限制性核酸内切酶Xba Ⅰ、BamH Ⅰ，真核细胞表达载体pcDNA3.1，半定量RTPCR及SYBR Premix Ex TaqTM实时定量PCR试剂盒均购自TaKaRa公司;引物由TaKaRa公司合成。Rho A鼠抗人单克隆抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物公司。其他试剂及实验所需仪器由东南大学医学院发育与疾病相关基因 教育 部重点实验室提供。 　　1.2 pcDNA3.1DLC1质粒的构建 　　以Xba Ⅰ和BamH Ⅰ 酶切鉴定载体pcDNA3.1。合成带有Xba Ⅰ和Bam HⅠ酶切位点的引物，上游序列：5′CTAGTCTAGATGTGCAGAAAGAAGCCGGACACCATGATCCTAACACAAATTGAAGCCAAGGAAGC3′(下划线为Xba Ⅰ酶切位点)，下游序列：5′CGCGGATCCTCACCTAGATTTGGTGTCTTTG3′(下划线为BamH Ⅰ酶切位点)。PCR扩增获得DLC1基因全长cDNA，酶切消化DLC1基因PCR目的片段。DLC1基因目的片段PCR产物连接入载体pcDNA3.1。1.3 脂质体法转染HT29细胞以及筛选稳定的细胞系 　　转染前1 d，换取新鲜含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，于 37 ℃、5% CO2 孵箱中培养，调整浓度为2×105 ml-1，以每孔2 ml接种于6孔培养板中培养。待细胞增至70%时，将重组pcDNA3.1DLC1质粒和pcDNA3.1空载质粒转染HT29细胞，质粒脂质体复合物(质粒∶脂质体= 1∶3)转染至细胞中，4 h 后弃去转染液，换新鲜培养液继续培养1 d，再弃去培养液，用含G418(400 μg·ml-1)的1640培养液进行筛选，14 d后收集G418 抗性细胞，用于实验。实验分为对照组(野生型HT29细胞)、空白载体组(pcDNA3.1HT29细胞)和转染组(pcDNA3.1DLC1HT29细胞)。 　　1.4 Rho A蛋白活性检测 　　采用pulldoerase chain reaction, PCR)检测DLC1基因表达，反应条件为：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环;72 ℃延伸7 min，终产物用1.5%的琼脂糖进行电泳鉴定。实时定量PCR检测Cyclin D1 及p21基因表达(ABI 7300 Thermocycler)，依照SYBR Premix Ex TaqTM kit说明进行，结果用2ΔΔCT法分析[6]。所用引物序列见表1。 　　1.7 统计学处理 　　实验数据采用SPSS 11.0 统计软件进行析因、相关性分析。计数资料用Nonparametric Tests 中的Independent Samples过程，计量资料用pare Means 中的One(sterile alpha motif)[12]与START(steroidogenic acute regulatory related lipidtransfer)[13] 也参与调节细胞形变和运动。还有报道DLC1的作用需定位于黏着斑，与黏附分子家族成员tensin 相互作用[14]。因此，DLC1发挥抑癌作用的机制是相当复杂的，需要进一步深入研究。 　　总之，本实验结果证明转染DLC1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下降，进而可能通过对Cyclin Dl、p21表达的调控引起细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡，同时分裂前期细胞数减少，细胞增殖受抑。其中涉及的具体信号通路仍值得进一步探讨。 【 参考 文献 】 　　[1]YUAN B Z,M ILLERM J,KECK C L,et al.Cloning,characterization,and chromosomal localization of a gene freq