乳酸菌超氧化物歧化酶基因的克隆与特性分析.doc

　　乳酸菌超氧化物歧化酶基因的克隆与特性分析 ：王小英，马文丽，郑文岭 【摘要】 目的：克隆乳酸菌超氧化物歧化酶(SOD)基因并进行特性分析。方法：根据已报道的乳酸菌SOD基因序列,采用PCR技术获得SOD碱基序列，将所得的PCR产物插入克隆载体pMD18T中,重组质粒经酶切, PCR鉴定及测序,获得的序列进行生物信息学分析。结果：成功克隆了SOD基因，序列分析表明，该SOD基因由621 bp组成，编码206个氨基酸残基，蛋白分子量为23 KD，等电点为4.96。结论：该蛋白氨基酸序列主要以α螺旋为主。 【关键词】 乳酸菌;超氧化物歧化酶;基因克隆 　　[ABSTRACT] Objective: To clone and make characteristic analysis of superoxide dismutase (SOD) in lactic acid bacteria. Methods: Based on reported geic sequence of SOD in lactic acid bacteria, obtained base sequence of SOD by PCR. Inserted product of PCR into cloning vector pMD18T, and made enzyme digestion of rebinant plasmid. Implemented PCR identification and sequencing, and made bioinformatics analysis of sequence. Results: SOD gene ino acid residues, olecular ain sequence of protein animo acid is alpha helix. 　　[KEY cCord和Fridovich从牛血红细胞中发现和分离提取以来[1]，由于SOD在抗氧化、抗肿瘤、抗衰老以及对抗细胞细胞凋亡[25]等方面起着重要作用，在医药、食品、保健品、化妆品等行业中具有广阔的应用前景。目前SOD大多是从天然动植物中提取，但是，提取法由于天然原料含量极微、提取工艺复杂等原因导致制品纯度低，产量少。为解决的限制问题，寻找比较 经济 的途径是必要的。利用微生物特别是基因工程微生物制取SOD的研究日益受到关注[6,7]。 　　乳酸菌是一类重要的 工业 微生物，乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，增加食品保藏期和附加值，而且具有特殊生理活性和营养功能。乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，具有降低血清胆固醇、抗肿瘤、抗衰老和免疫赋活作用[8,9]。研究证实，乳酸菌具有不同的抗氧化活性，乳酸菌的无细胞提取物具有清除机体羟自由基、过氧化氢的能力[10,11]。虽然乳酸菌的抗氧化活性已得到了证实，但它在体内的作用机制还不是很清楚，关于它的作用机制和抗氧化活性有关的物质需要进一步的研究。关于乳酸菌抗氧化性的研究越来越多地受到食品 科学 、预防医学等许多学科学者的广泛重视。本研究中，乳酸菌SOD基因的克隆及生物信息学分析将为乳酸菌抗氧化性的进一步研究及用基因工程方法大批量生产SOD奠定基础。 　　 1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株与质粒 乳酸乳球菌购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心;大肠杆菌DH5α由本室保存;pMD18T购买于北京天根生化科技有限公司。 　　1.1.2 试剂材料 细菌培养试剂购于Sigma公司; LA DNA聚合酶、T4连接酶购自大连宝生物公司;细菌基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、DNA Ladder购自北京天根生化科技有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 乳酸乳球菌基因组DNA的提取 用灭菌双蒸水溶解干冻管里的乳酸乳球菌，并划平板到MRS固体培养基，37 ℃培养72 h，挑取单个菌落于MRS液体培养基于37 ℃摇床进行增菌。利用天根生化科技有限公司细菌基因组提取试剂盒提取乳酸乳球菌基因组DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。 　　1.2.2 引物设计与合成 所用引物根据GenBank中乳酸乳球菌超氧化物歧化酶基因(SOD)碱基序列(GenBank序列号：GeneID:1114019)设计。 　　P1：5CGC GGATCC GCG ATGGCATTTACATTA3 　　P2：5 CCG CTCGAG CGG TTATTTTGCTTTAGCAT3 　　上述引物由上海Sangon生物工程技术服务有限公司合成 (下划线碱基分别为BamHI和Xho I酶切位点)。 　　1.2.3 超氧化物歧化酶SOD基因的PCR扩