亚低温治疗对大鼠缺血性脑损伤后热休克蛋白表达的影响.doc

　　亚低温治疗对大鼠缺血性脑损伤后热休克蛋白表达的影响 【关键词】 亚低温;脑缺血;热休克蛋白70 Abstract Objective: To investigate the effectiveness of mild hypothermia therapy on heat shock protein(Hsp) expression in rats ia. Methods: 48 SD rats ly divided into the trial group(the mild hypothermia group) and the control group. Each group e, odels of focal cerebral ischemia odified Longa method. The rats in the trial group ild hypothermia for tmunohistochemistry method ed to confirm the expression of the Hsp 70 at thepenumbra fieldin rat brain tissue. Results: The expression of the Hsp70 in rats of the trial group e point , there ild hypothermia therapy decreases the peripheral penumbra size of cerebral infarction tissues and the expression of Hsp70 in rats ia and possesses protective effect on ischemic brain. Key ia; Brain ischemia; Heat shock protein 70 低温一般分为轻度低温(mild hypothermia)(33～35℃)；中度低温(moderate hypothermia)(28～32℃);深度低温(profound hypothermia)(17～27℃);超深低温(ultraprofound hypothermia)(2～16℃)。亚低温一般指32～35℃的低温，亚低温脑保护的研究已有数十年 历史 ,脑组织热休克蛋白70 (Heat-shock protein 70,Hsp70)主要存在于缺血半暗带，本研究通过观察亚低温处理后实验大鼠缺血区脑组织内Hsp70含量的变化,探讨亚低温的脑保护机制。 1 材料与方法 1.1 动物分组 健康SD大鼠雌雄不计共48只，体重300～330g，随机分为两组：亚低温组和常温组，每组在术后又分为12小时、24小时、48小时3个亚组。 1.2 脑缺血模型的制备 参照改良的Longa栓线法[1]构建大鼠局灶性脑缺血模型,用2%戊巴比妥钠按45mg/kg体重腹腔内注射麻醉，麻醉成功后，仰卧位固定于手术台，亚低温组头枕冰帽，测颞肌温度，待颞肌温度低于35℃时开始手术，并将温度控制在32～35℃之间2小时，常温组麻醉成功后即可手术。 1.3 选入标准 （1）提尾后右前肢内收屈曲，（2）爬行时向右侧划圈（“追尾现象”），（3）站立时向右侧倾倒。凡具有上述体征之一者可入选本实验。 1.4 免疫组化 将脑缺血12小时、24小时、48小时后每组动物各8只,常规灌流,具体做法为在规定的时间点以过量的10%水合氯醛再次麻醉大鼠后,迅速暴露心脏,向左心室内插管,同时剪开右心耳,先向左心室中迅速灌入0.9%氯化钠溶液约250mL,当大鼠右心耳流出的液体变为无色时再向左心室内灌入新配制的4%多聚甲醛磷酸缓冲液250mL，等待大鼠肢体僵硬后迅速断头取脑, 标本入-20℃冰箱冷冻15分钟后做连续冠状切片,片厚2mm,共6片,留取第4片(B-2.2至B-4.2区)入4%多聚甲醛后固定以作冰冻切片之用,其余厚片用于TTC染色,第4片后固定后在恒低温切片机上制成片厚30μm的冰冻切片,用于免疫组化和HE染色。 1.5 TTC染色 将脑组织置于-20℃下冷冻20分钟，放入10%TTC溶液(2,3,5- Triphyltetrazolium)，避光，37℃恒温水浴箱孵育30分钟，继以4%多聚甲醛缓冲液后固定3～5天,非梗死区呈红色,梗死区不着色。 1.6 HE染色 用10%甲醛溶液固定24小时以上,石蜡包埋切片,HE染色,显微镜下观察脑组织病理改变。 1.7 热休克蛋白70测定 第4片后固定后在恒低温切片机上制成片厚30μm的冰冻切片制成石蜡块，用石蜡切片机切成 20μm切片，捞片后置于烤箱，58～60℃烤30分钟后取出；加枸橼酸缓冲液