从水通道蛋白4的表达探讨脾胃湿热证的机理.doc

　　从水通道蛋白4的表达探讨脾胃湿热证的机理 　　摘要：【目的】从水液代谢角度探讨脾胃湿热证的机理。【方法】慢性浅表性胃炎患者57例，其中脾胃湿热证35例，脾气虚证22例；另设10例正常人为对照。胃镜下取胃体上部粘膜，分别用免疫组化法、荧光定量PCR法检测粘膜组织中的水通道蛋白4(AQP4)的蛋白表达和信使核糖核酸(mRNA)表达。【结果】脾胃湿热证组AQP4蛋白表达量高于脾气虚证组(Ｐ＜００1)和正常组(Ｐ＜００5)，AQP4mRNA表达量亦高于脾气虚证组(Ｐ＜００1)和正常组(Ｐ＞００５)；而脾气虚证组的AQP4基因表达量和蛋白表达量均低于正常组，其中两组的AQP4基因表达量有显著性差异(Ｐ＜００5)，但两组的蛋白表达量差异则无显著性(Ｐ＞００5)。【结论】与水液代谢密切相关的AQP4异常表达可能是脾胃湿热证的发生机制之一。 　　关键词：脾胃湿热/诊断；水孔蛋白类；胃炎/诊断 　　中医认为脾主运化、主升清、主统血，为后天之本。脾在五脏中的重要地位是学术界对其研究一直没有停止的原因。近年来脾实质的研究，证型上集中在脾虚证的研究，功能上集中在“脾主运化、尤其脾主运化水谷”的研究，而关于脾胃实证和“脾主运化水液”的研究较少［１－２］。现代医学认为，水通道蛋白(aquaporin，AQP)是生物膜上特异性转运水的整合蛋白质，参与调节水平衡；在胃粘膜中主要是AQP4的表达［３５］。本文以水液代谢为切入点，研究脾胃湿热证与AQP4之间的关系。 　　1资料 　　11一般临床资料 　　从2002年1月到2002年10月在广州中医药大学第一附属医院门诊部和住院部共收集慢性浅表性胃炎患者57例，其中辨证属脾胃湿热证者35例，脾气虚证者22例。另选取正常人10例作为对照，来自广州中医药大学第二临床医学院的本科志愿学生。所有受试对象均签订知情同意书。脾胃湿热证组中，男19例，女16例，年龄18～４０岁，平均(253±57)岁；脾气虚证组中，男12例，女10例，年龄１８～４２岁，平均(294±77)岁；正常组10例，年龄１８～２５岁，平均(214±17)岁。 　　12诊断标准 　　121西医诊断标准慢性浅表性胃炎的诊断标准参照中华医学会消化病学分会2000年井冈山会议制定的标准［６］。 　　122中医诊断标准脾胃湿热证和脾气虚证的诊断标准参照2002年国家药品监督管理局颁布的《中药新药临床研究指导原则》［７］。 　　脾胃湿热证：主症为①脘腹胀闷；②口渴少饮；③食少纳呆；④大便溏而不爽；⑤舌质红，舌苔黄腻。次症为： 　　①肢体困重；②身热不扬或汗出不解；③腹胀满；④恶心欲吐；⑤身目黄色鲜明；⑥脉濡数。具备主症3项(舌象必备)；或具备主症两项(舌象必备)，加次症两项，即可诊断为脾胃湿热证。 　　脾气虚证：主症为①食少纳呆；②体倦乏力；③食后或午后腹胀；④大便异常(溏、烂、先硬后溏、时溏时硬)。次症为①神疲懒言；②口淡不渴；③腹痛绵绵；④恶心呕吐；⑤脘闷或肠鸣；⑥面色萎黄；⑦浮肿；⑧排便无力；⑨舌质淡，舌体胖或有齿印，苔薄白；⑩脉细弱。具备主症两项；或具备主症1项加次症两项，即可诊断为脾气虚证。 　　123正常人的诊断标准无心、肝、脾、肺、肾等系疾病，常规实验室检查正常，胃粘膜胃镜征象和病理组织学基本正常，舌、脉象正常。 　　 　　13试验材料与仪器羊抗人AQP4的多克隆抗体购自SantsCruz生物技术有限公司；生物化二抗、链霉素亲和素生物素复合物法(SABC)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德公司；Trizol、TaqDNA多聚酶、MMV逆转录酶、四种脱氧核糖核酸(dNTPs)购自美国Gibco公司；参照NCBI的genbank，AQP4引物和荧光探针由中山大学达安基因诊断中心设计合成，序列为：正义链引物5GAATCCCGCCCGATCCT3’，反义链引物5ATATCCAATGGTTTTCCCAATTTC3’，荧光探针5FAMTGGACCTGCAGTTATCATMGB3(探针的5端标以荧光报告基因FAM，3’端标以荧光淬灭基因MGB)，AQP4扩增片段长度为62?bp；GeneAmpPCRSystem?9700(普通PCR仪)和ABIPRISM7000SequenceDetectionSystem(全自动荧光定量PCR仪)，均为美国AppliedBiosystems公司产品；GIF-240XQ型电子胃镜为日本Olympus公司产品。 　　2方法 　　21病理取材所有受试对象均行电子胃镜检查，胃体距EG线?2?cm处的大、小弯处分别钳取胃粘膜组织4块，每块?05?cm×?05?cm大小，2块组织放入?40g/L?多聚甲醛中，2块组织放入液氮罐中。 　　22AQP4表达的检测根据获得的组织数目，慢性浅