外排系统与膜通透性的改变对淋球菌高水平多重耐药的影响.doc

　　外排系统与膜通透性的改变对淋球菌高水平多重耐药的影响 ：王冬梅，王勇，夏忠弟，田峰，邹明祥 【摘要】 　　目的 探讨外排系统与膜通透性的改变对淋球菌多重耐药的影响。方法 PCR扩增淋球菌mtrR启动子区域包含13bp回文序列在内的157个碱基片段并进行DNA测序分析；提取外膜蛋白，利用SDSPAGE进行组成型的分析。结果 5株敏感株的mtrR启动子区域未发生突变，3株高水平多重耐药株的mtrR启动子区域13bp回文序列均发生了单个A/T碱基的缺失，且均存在外膜孔蛋白表达的缺失。结论 mtrR启动子区域13bp回文序列单个A/T碱基的缺失引起的mtrCDE外排泵表达增加与外膜孔蛋白表达的缺失或下降导致的膜通透性降低，在介导淋球菌产生高水平多重耐药中起一定的作用。 【关键词】 淋球菌 多重耐药 mtr 孔蛋白 　　ABSTRACT: Objective To investigate the impact of functional enhancement of efflux pump system and reduced permeability of outer membrane on highlevel multiple resistant Neisseria gonorrhoeae. Methods Several highlevel multiple resistant isolates ycin MIC=128.0mg/L, acpanied by concurrent resistance to several antimicrobial agents, trR promoter region plified by PCR and directly sequenced to detect the possible gene change. The outer membrane proteins of the strains utations in 5 sensitive strains. All the 3 highlevel multiple resistant strains contained the same mutation and exhibited a single A/T base pair deletion in 13bp inverted sequence positioned trR promoter region. Meanent of efflux pump system induced by a single A/T base pair deletion in 13bp inverted sequence positioned trR promoter region and the decreased cell envelope permeability induced by the absence of porin protein may have some effect on mediating highlevel multiple resistance in Neisseria gonorrhoeae. 　　KEY IC)均为128.0mg/L。 　　1.2 主要试剂 　　dNTP、pfu高保真酶、月桂酰基肌氨酸钠购自上海生物工程技术服务公司，丙稀酰胺为BBI公司进口分装，甲叉双丙稀酰胺购自英国Aldrich公司。 　　1.3 PCR扩增及产物测序 　　①模板DNA的制备：取培养24～36h的淋球菌菌落20～30个于30μL双蒸水中，煮沸10min，2000r/min离心8～10min，取上清液做模板。②PCR反应条件：引物参照 文献 [1]设计的序列，由大连宝生物公司合成。上游引物：5′GCTTTGATACCCGAATGTTCG3′，下游引物：5′CGTTTCGGGTCGGTTTGACG3′。扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性60s，55℃退火45s，72℃延伸60s，最后72℃延伸6min，共32个循环。③PCR产物测序分析：由上海博亚生物技术开发公司完成。 　　1.4 外膜蛋白组成型的分析 　　①外膜蛋白的提取和分离：参见文献[2]。②十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)：制备40g/L浓缩胶和120g/L分离胶，电泳：取10μL(约10μg)蛋白＋3×SDS buffer 5μL混匀，煮沸3～5min后上样，14mA电泳1h左右，待指示剂电泳至合适的位置后停止电泳，染色、脱色后照相进行凝胶扫描图像分析。 　　 2 结 果 　　2.1 PCR扩增结果及测序分析 　　58株细菌和ATCC19424均能扩增出mtrR157