大孔树脂分离治伤灵口服液中芍药苷的研究.doc

　　大孔树脂分离治伤灵口服液中芍药苷的研究 【关键词】 D101大孔树脂 芍药苷 治伤灵口服液 分离 治伤灵口服液是在桃红四物汤的基础上研制而成的复方制剂，主要由川芎、赤芍、桃仁、红花等十二味药材，通过水蒸汽蒸馏法提取挥发油，正交试验优化水提醇沉工艺制备而成的口服液，主要功效为活血化瘀、补肾强骨等，具有显著的降压、抗炎、扩张冠脉血管等作用。近年来大孔树脂吸附技术在中药精制工艺中的应用日益广泛，而D101大孔树脂对皂苷的吸附性能较好，故本研究旨在优化D101大孔树脂对治伤灵口服液中芍药苷的分离纯化工艺，最大限度的分离、纯化出治伤灵口服液中的芍药苷，为治伤灵口服液的含量测定提供最佳分离纯化工艺。 　　1 仪器和材料 　　1200型HPLC（美国Agilent公司）；AE200型 电子 天平（瑞士Mettler公司）；pHS–3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）；层析柱（10mm×300mm）；D101型大孔树脂（成都市科龙化工试剂厂，批号；芍药苷标准品（ 中国 药品生物制品检定所，批号：110736-200731）；甲醇为色谱纯；水为重蒸水；95%乙醇（药用，成都市蓉康医疗保健实业有限公司）。 　　2 方法与结果 　　2.1 芍药苷的含量测定 　　2.1.1 供试液的制备 按处方比例称取药材，其中当归、川芎、柴胡等提取挥发油，药渣与剩余药材混合，加水8倍量，煎煮3次，每次1 h，合并滤液，将其浓缩为1.10～1.14 g·ml-1的浸膏，放冷，加入乙醇使醇沉浓度为70%，静置48小时后滤过，滤液回收乙醇，放冷，加入炼制好的蜂蜜，混匀，再缓缓加入挥发油及0.04%对羟基苯甲酸乙酯，加水至全量，调节pH 值，搅拌均匀，即得。 　　2.1.2 阴性对照溶液的制备 按比例称取除赤芍以外的处方药材，按供试液的制备方法制备。 　　2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品10mg于100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度。 　　2.2.4 色谱条件［1］ 色谱柱：Agilent Zorbax SBC18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相：甲醇水（35∶65），流速：1ml·min-1，检测波长：λ=230 nm，柱温：30℃。 　　图1 芍药苷色谱图（略） 　　（A.标准品；B.阴性对照；C.供试品；1.芍药苷） 　　Fig 1 HPLC chromatogram of paeoniflorin 　　(A. reference substance；B. negative sample； C.sample； 1. paeoniflorin) 　　2.2.5 绘制标准曲线 按上述色谱条件，分别进样对照品溶液2、4、8、10、12、16 μl，记录峰面积（Y），以芍药苷的进样量(X，μg)为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y =1449.9X+8.2337，相关系数r=0.9999。结果表明，在0.2 μg～1.6 μg范围内芍药苷含量与峰面积成良好线性关系。图1为芍药苷的色谱图。 　　2.2.6 仪器精密度试验 取对照品溶液10μL,按上述色谱条件连续进样6次， 计算 芍药苷色谱峰峰面积的RSD为 0. 57%。 　　2.2.7 稳定性试验 取供试品溶液1ml于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液10μL,分别于0，1， 2， 4， 8 ，12 h进样测定，计算峰面积的RSD值, 芍药苷的RSD为 0.766%。表明样品溶液在12 h内稳定。　 　　2.2.8 最低检测限 将芍药苷对照品溶液稀释进样,以信噪比为3∶1，芍药苷最低检测限为18.54 ng。 　　2.2.9 回收率试验 采用加样回收率方法，精密量取已知含量样品共9份，定量加入芍药苷对照品，测定含量。结果见表1。 　　表1 加样回收率试验结果（略） 　　Tab.1 The recovery test of paeoniflorin 　　2.3 大孔树脂的预处理 取适量D101大孔吸附树脂，95%的乙醇充分浸泡后并用乙醇多次洗涤，直至上清液于试管中加入适量蒸馏水无白色浑浊为止，再用去离子水洗至无明显乙醇气味即可，最后转入酸碱处理，即用5%的盐酸溶液浸泡3 h，然后用去离子水洗至pH值为中性，接着用5%NaOH溶液浸泡3 h，然后用去离子水洗至pH值为中性即可。 　　2.4 吸附条件的确定 　　2.4.1 酸碱对芍药苷稳定性的影响 分别精密量取0.2 mol·L-1NaOH溶液、氨试液、0.2 mol·L-1HCl溶液与芍药苷标准溶液（0.1 mg·ml-1）等量混合，每0.5 h测定一次含量。结果，1 h后，NaOH溶液和氨试液中芍药苷被降解完全，而HCl溶液中芍药苷含量