小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、CD34、组织蛋白酶D表达意义.doc

　　小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、CD34、组织蛋白酶D表达意义 【摘要】 目的 动态观察CD31、CD34、组织蛋白酶D在黑色素移植瘤血管生成拟态形成(VM)中的表达。方法 制作小鼠黑色素移植瘤动物模型，成瘤后每天随机抽取1只小鼠处死，12 d共获得肿瘤样本114例;行HE染色、CD31、CD34、组织蛋白酶D免疫组化染色。结果 移植瘤早期存在VM，晚期被内皮依赖性血管替代;VM周围肿瘤细胞中CD31、CD34阳性百分率高于远离VM区域的阳性百分率;内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31阳性百分率与远离内皮依赖性血管区域的阳性百分率之间存在差别;VM周围肿瘤细胞组织蛋白酶D阳性百分率高于内皮依赖性血管周围的阳性百分率;VM密度与VM周围肿瘤细胞CD31、CD34阳性百分率相关;内皮依赖性血管密度只与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞中CD31阳性百分率相关。结论 移植瘤中VM是暂时性血液供应方式;组织蛋白酶D、CD31、CD34均与黑色素移植瘤VM形成有关。 【关键词】 血管生成拟态; 肿瘤血管生成; 细胞黏附分子;恶性黑色素瘤;组织蛋白酶D 　 血管生成拟态形态(VM)是肿瘤细胞变形并相互黏附形成的暂时血液供应模式，与内皮血管共存并密切相关，CD31、CD34是血管内皮标记物，均与血管新生有关，而与VM的关系未见报道;组织蛋白酶D是肿瘤细胞浸润间质重要的蛋白酶，与肿瘤细胞外基质重塑相关，本实验通过对肿瘤VM中上述各种指标表达的动态变化的研究，探讨其在VM形成中的作用。 　 　1 材料与方法 　　1.1 实验动物与方法 C57小鼠购自北京军事医学 科学 院动物室，6～8周龄，共20只，雌雄各半，体重25～30 g，编号后洁净实验室饲养。B16细胞株复苏，1640细胞培养基培养6 d，0.2%胰酶消化，调整细胞密度达到1×107/ml。75%乙醇消毒小鼠蹊部，每只小鼠皮下注射0.2 ml细胞悬液，多处种植。10 d后成瘤，根据随机数字表每天处死1只小鼠，共12 d。获取所有肿瘤样本114个。10%甲醛固定，常规石蜡包埋。 　　1.2 免疫组织化学染色 　　1.2.1 试剂 鼠抗小鼠CD31、CD34、组织蛋白酶D单克隆抗体，购自福建迈新试剂公司，0.1 ml包装，工作浓度1∶50;二抗、三抗为SP复合物和山羊抗兔PV6001，购自北京中山试剂公司。 　　1.2.2 免疫组化主要步骤 二甲苯脱蜡、梯度乙醇至水，3%过氧化氢灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，抗原微波热修复，山羊血清封闭、一抗4℃过夜，二抗、三抗各孵育1 h，DAB显色10～15 min，复染核脱水透明，中性树胶封固。 　　1.3 计数方法 　　1.3.1 区域划分 中央区与外周区的划分：避开肿瘤坏死,将每张切片中肿瘤组织镜下视野均匀分成3等份，内1/3区域为中央区，外1/3为外周区。VM周围与远离VM、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的划分：以VM、内皮依赖性血管为中心的高倍视野定义为VM、内皮依赖性血管周围;距离上述视野1个高倍视野的肿瘤细胞即为远离VM和内皮依赖性血管。 　　1.3.2 计数 低倍镜下找到典型区域，在高倍镜下(×400)连续计数10个高倍视野内的VM、内皮依赖性血管，其均值即为VM密度、内皮依赖性血管密度;计数VM周围、内皮依赖性血管周围、远离VM、远离内皮依赖性血管区域肿瘤细胞中阳性细胞数。 　　1.4 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件，两样本之间作Mann周围各指标的表达与VM密度、微血管密度之间作直线回归相关分析。 　　 2 结 果 　　2.1 常规形态学观察 肿瘤直径4 mm～1.5 cm，血管丰富，浸润生长，周界不清，部分区域散在出血坏死。镜下可见肿瘤细胞周围形成没有内皮细胞衬覆的不规则腔隙，内可见红细胞，即VM，共26例。中央区VM较多见，外周区VM较少。内皮依赖性血管多位于移植瘤外周区。在移植瘤成瘤的第1～8天可见到典型的VM样结构，至第9～12天被内皮依赖性血管所替代。中央区的VM密度在移植瘤形成后的第1～3天呈递增趋势，第4～8天呈递减趋势。肿瘤外周区的VM密度在第1～4天呈现递增趋势，在第5～8天呈现递减趋势。从空间上对比两个区域内的血管生成拟态密度显示：在第1～6天肿瘤中央区的密度高于外周区的密度，在第7～8天肿瘤外周区的密度高于中央区的密度。内皮依赖性血管密度在肿瘤的中央区和外周区均呈现递减趋势。空间上对比两个区域内的内皮依赖性血管密度发现：在第1～7天肿瘤中央区的密度高于外周区密度，在第8～12天肿瘤两个区域内密度差别不明显。 　　2.2 各种指标在肿瘤不同区域的表达变化 规律 　　2.2.1 CD31在肿瘤不同区域的表达 肿瘤细胞表达CD31抗原，且围成VM的肿瘤细胞不表达或极少表达C