局部应用血管内皮生长因子基因对大鼠皮瓣不同部位作用的实验研究.docVIP

　　局部应用血管内皮生长因子基因对大鼠皮瓣不同部位作用的实验研究 ：吴莉，沈江涌，杨美玲，杨桂珍 【摘要】 目的局部应用血管内皮生长因子基因转染大鼠皮瓣，初步探讨其对皮瓣成活率的影响及对皮瓣不同部分促血管作用效果。方法将30只SD大鼠作为实验模型，随机分为3组，每组10只，制作背部随意皮瓣，分别注入脂质体包裹的PcDNAVEGF165(目的基因组，实验组)，PcDNA(空白质粒组，对照组)， NS(生理盐水组，对照组) 。术后4d断蒂，断蒂后7d处死大鼠观察：(1)各组皮瓣成活率比较。(2)取皮瓣远端活组织标本行常规HE染色，检测平均微血管数目及内径。(3)取皮瓣远端活组织标本行VEGF 免疫组化染色观察VEGF表达情况。(4)取目的基因组皮瓣远段，中段，近段成活组织标本常规HE染色，检测平均微皮瓣血管数目。结果目的基因组皮瓣平均成活率明显高于空白质粒组和生理盐水组两对照组，平均微血管数目明显多于两对照组，且为管径较小的新生血管，均具有统计学意义(Plt;0.05)。免疫组化染色强度高于两对照组。目的基因组皮瓣远端血管数目多于近端，具有统计学意义(Plt;0.05)。结论局部注射VEGF基因后可以增加缺血皮瓣血管新生，提高皮瓣成活率，在皮瓣不同部位促血管增生作用不同。 【关键词】 血管内皮生长因子;大鼠;皮瓣 　研究表明PTEN可以增加MMP-2抑制物TIMP-2的分泌[8]，TIMP-2可与MMP-2以1∶1形式形成复合物,抑制了MMP-2的活性。许雪峰[9]等研究MMP-2、PTEN的表达情况，发现联合检测两者可作为判断贲门癌侵袭转移能力的客观指标。在本组资料中二者在食管鳞癌中表达呈负相关(Plt;0.05)， 随着食管癌的进展，食管癌组织中MMP-2和表达升高，而PTEN则表达降低，推测PTEN基因可能通过影响MMP-2的表达而影响肿瘤细胞浸润转移，影响患者预后但具体的调控机制有待于进一步研究。 　　[Abstract]ObjectiveTo explore the topical application of vascular endothelial groodel of flap id group and NS ed and drug used，the pedicel easured. The microvessels ination. The expression of VEGF unohistochemical staining.ResultsThe average flap survival rate of the target gene group id group and saline group and control group. The average number of blood vessels significantly more than taller in diameter and angiogenesis (Plt;0.05). Immunohistochemical staining ic skin flap to improve flap survival rate，different parts of the flap to promote the role of different angiogenesis. 　　[Key HI和EcoRI两个酶切位点之间。将PcDNAVEGF165转化大肠杆菌HB101感受态细胞，挑选抗氨卞青霉素克隆进行小量快速提取，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，同时送北京华大生物有限公司进行双向测序鉴定是否为所要目的基因。将保存的大肠杆菌菌种通过碱裂解法大量提取质粒，聚已二醇8000纯化。制备的质粒经核酸，蛋白微量仪测定(美国BIO-RAD公司)定量为12.5μg/μl,以生理盐水稀释为浓度1μg/μl备用。 　　1. 2脂质体的制备与基因包裹： 　　用 电子 分析天平称取磷脂酰胆碱(PC,sigma 公司)20mg,胆固醇(Chol,sigma 公司)10mg倒入旋转烧瓶中。用量筒取氯仿60ml,甲醇20ml，倒入高压灭菌球形旋转烧瓶中溶解磷脂酰胆碱、胆固醇。将旋转烧瓶温度调整在70℃左右，转速为45次/min。待溶液完全蒸干，形成白色光滑膜附着于烧瓶壁，温度冷却后加入5ml乙醚，加入40ml含有PCD-VEGF165缓冲液(用生理盐水稀释原液至1ml含100μg PCD-VEGF165的缓冲液)。在70℃低转速10转/min洗膜，蒸6min后乙醚基本除尽。将超声探头放入液体中，通电5min形成均匀乳白色液，静置2h不分相。将液体分装1.0ml(质粒100μg)在1.5ml高压灭菌的Eppendorf管中备用。 　　1.3动物分组与皮瓣设计: