川芎嗪对体外血管内皮祖细胞氧化损伤的保护作用.doc

　　川芎嗪对体外血管内皮祖细胞氧化损伤的保护作用 ：李岚，姚玉宇，马根山，范国峰 【摘要】 目的： 研究川芎嗪对过氧化氢（H2O2）诱导的内皮祖细胞（EPCs）氧化应激损伤的保护作用。方法： 　采用密度梯度离心法获取兔外周血单个核细胞，EBM2完全培养基诱导分化，并对培养7 d的细胞进行免疫荧光及免疫细胞化学方法分析。实验分为正常对照组、H2O2组及H2O2川芎嗪预处理组，以600 μmol·L－1H2O2诱导EPCs氧化应激损伤，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，测定细胞浆中丙二醛（MDA）含量和细胞培养液上清总超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）活力。结果： 　兔外周血单个核细胞诱导培养7 d，Ｄil标记的乙酰化低密度脂蛋白（DilacLDL）内吞和荆豆凝集素（FITCUEA1）双染色阳性，免疫细胞化学显示培养细胞CD31/CD34/VEGFR2阳性，证实为EPCs；流式细胞分析显示，H2O2组细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.01），川芎嗪预处理组明显抑制H2O2 诱导的EPCs凋亡（与H2O2组比较，P＜0.05）；H2O2可导致 EPCs MDA、LDH含量明显增加和SOD活性下降，而用川芎嗪预处理可明显抑制EPCs的氧化应激反应（与H2O2组比较，P＜0.05）。结论： 川芎嗪对H2O2 诱导的EPCs氧化应激损伤有一定的保护作用，其机理可能与其抗凋亡和抗脂质过氧化有关。 【关键词】 川芎嗪； 内皮祖细胞； 过氧化氢； 氧化应激损伤； 兔 研究发现，活性氧（ROS）族的过度产生会导致内皮细胞的氧化应激，造成内皮功能障碍。血管内皮祖细胞（EPCs）是血管内皮的前体细胞，亦称为成血管细胞（angioblast），是一类具有游走、增殖并能分化为成熟血管内皮细胞，但缺乏成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞［1］。研究显示，EPCs能参与血管内皮的新生，因此对心血管疾病有重要的保护作用；但心血管疾病产生大量的ROS，使EPCs动员、迁移、增殖及分化等功能严重受损，加速心血管疾病的发生 发展 。研究［23］表明，他汀类药物可通过促进EPCs功能改善而参与冠心病内皮损伤后的修复。本实验观察过氧化氢（H2O2）对EPCs氧化损伤、凋亡的影响，探讨H2O2对EPCs的损伤效应以及中药川芎嗪（以下按其化学结构而简称为TMP）对其的保护作用。 1 材料和方法 1.1 材料 盐酸ＴＭＰ（哈尔滨三联制药有限公司），新西兰大白兔4只（雌性，体重2.5 kg，东南大学医学院实验动物中心），Ficoll淋巴细胞分离液（天津灏洋生物有限公司），EBM2培养液（Lonza公司），人血浆纤维连接蛋白（FN，Chemicon公司），磷酸盐缓冲液（北京中杉有限公司），鼠抗人CD31单克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体（晶美生物工程有限公司），鼠抗兔VEGFR2单克隆抗体（TBD公司），Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（DilacLDL）、FITC标记的荆豆凝集素1（FITCUEA1）（Vector Laboratries公司），凋亡检测试剂盒（凯基生物工程有限公司），丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），余试剂均为市售分析纯。 1.2 实验仪器 FACS Canto流式细胞仪，Nikon倒置相差显微镜，HEAL FORCE HF90细胞培养箱，Biofuge冷冻离心机，LSM510激光共聚焦显微镜，SK1混匀器（常州国华电器有限公司），722N型可见分光光度计（上海精密仪器有限公司），XHF1内切式高速分散器（上海金达生化仪器厂），HH4恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），802型低速离心机（上海手术器械厂），Multiskan Spectrum Spectrophotometer酶标仪（Thermo Fisher Scientific）。 1.3 方法 1.3.1 兔外周血内皮祖细胞分离、培养 新西兰大白兔用3％戊巴比妥钠静脉麻醉，心脏穿刺抽取外周血20 ml，将抽出的外周血与等体积PBS混合重悬后，小心叠加于等体积Ficoll淋巴细胞分离液上，保持界面清晰，2 000 r·min－1离心20 min，吸取中间云雾层细胞，5倍体积PBS重悬，1 500 r·min－1离心10 min，洗涤2次，末次离心后弃上清，EBM2完全培养基重悬细胞，接种于包被FN的培养瓶内，部分接种于预先铺有盖玻片的24孔板中，放入37 ℃、5％CO2培养箱内培养，3～4 d换液1次，约2周细胞长满瓶底，达到融合期。培养瓶内细胞以0.25％胰蛋白酶消化传代用于实验。24孔板中细胞爬片进行免疫荧光及免疫细胞化学分析。 1.3.2 内皮祖细胞