用Gateway技术克隆并表达汉滩病毒G1蛋白ITAM样基序.doc

　　用Gateway技术克隆并表达汉滩病毒G1蛋白ITAM样基序 【摘要】 目的：克隆并表达汉滩病毒（HTNV）囊膜糖蛋白（G1）胞质区尾段ITAM样基序及其突变体. 方法：采用RTPCR方法，扩增HTNV G1蛋白ITAM样基序及其中2个保守酪氨酸残基突变基序编码基因，应用Gateutated G1ITAMlike sequence constructs of Hantaan virus. METHODS: G1ITAMlike sequenceencoding genes of Hantaan virus plified from cDNA of the virus strain 84FLi using RTPCR. Mutagenesis of the ITAMlike sequence ed pENTRTM/DTOPO. The rebination reaction ed using Gatee mix to transfer the desired genes into the Gateed by L (aa569aa642), pDESTITAM (aa602aa634) and pDESTITAMYYFF (Y615F, Y628F), easured by SDSPAGE. like sequences munoreceptor tyrosinebased activation motifs 　　0引言 　　肾综合征出血热(HFRS)在我国广为流行，严重危害人民的生命健康［1］. 汉滩病毒（HTNV）引起的HFRS重危症多，病死率高，其发病机制尚未阐明. Geimonen等［2］的研究表明免疫受体酪氨酸酶活化基序（ITAM）—免疫受体活化性信号传递有关的一段以两个酪氨酸残基为中心的序列［3］存在于HPS相关病毒囊膜糖蛋白1（glycoprotein 1, G1）胞质区尾段，具有免疫受体ITAM相似的功能. HFRS相关HV（HTNV，SEOV，DOBV）的G1胞质区存在ITAM样基序（ITAMlike sequences），基本形式为YxxLx9YxxT. HTNV与HPS相关病毒同属于汉坦病毒（hantavirus, HV）属，基因结构有较高的同源性. 我们以此为切入点，克隆并表达HTNV G1蛋白ITAM样基序及其突变体，获得G1 ITAM样基序及其突变基序的融合蛋白，为进一步探讨HTNV G1蛋白ITAM样基序在HFRS免疫信号传递中的作用奠定基础. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　HTNV 84FLi株由中国预防医学科学院病毒学研究所出血热及虫媒病毒研究室保存. Gateega公司)；PyrobestTM DNA多聚酶和DNA标准DL2000，DL15 000(日本TaKaRa公司)； SuperScriptTM II逆转录酶和GateAb(美国Chemicon公司)；细菌GST融合蛋白柱纯化试剂盒(美国PIERCE公司)；总RNA提取试剂盒TRIZOL LS(美国Gibco公司)；生物素标记的山羊抗小鼠IgG，链酶亲合素—过氧化物酶复合物，二氨基联苯胺（DAB），葡萄糖氧化酶及小量质粒抽提纯化试剂盒(美国Sigma公司)；预染蛋白标准(美国纽英伦生物技术有限公司). 　　1.2方法 　　1.2.1病毒RNA提取以0.01～0.1感染复数(MOI)的HTNV疫苗生产株84FLi感染VeroE6细胞，待间接免疫荧光法检测细胞质中特异性荧光达到～时收获病毒，参照Trizol试剂盒操作说明提取病毒感染细胞总RNA. 　　1.2.2引物设计与基因合成参照HTNV国际标准毒株76~118株［3］，中国代表株A9株（GenBank注册号：AF345636）及84FLi株（GenBank注册号：AF035831）核苷酸序列，设计用于扩增HTNV G1胞质区尾段aa569aa642和aa602aa634编码序列（含ITAM样基序的编码基因）的PCR引物FP1，RP1和FP2，RP2，由TaKaRa公司合成；同时合成一段突变G1 ITAM样基序中两个保守的酪氨酸残基(Y615F，Y628F)的G1胞质区尾段aa602aa634的编码基因，连接入pMD18中构建成克隆载体pMDITAMYYFF. 　　1.2.3RTPCR以提取病毒感染细胞的总RNA为模板，以14 bp随机引物和RP1为反转录引物，采用SuperScriptTM II逆转录酶按常规方法进行反转录；以合成的cDNA及pMDITAMYYFF为模板，分别以FP1, RP1和FP2, RP2为引物应用PyrobestTM DNA多聚酶进行扩增，退火温度分别为55℃和6