用MTT比色法建立B型CpG ODN活性检测标准.doc

　　用MTT比色法建立B型CpG ODN活性检测标准 ：王学菊, 刘璟, 万敏, 王莉, 吴秀丽, 卫红飞, 于永利, 王丽颖 【摘要】 　　目的: B型CpG ODN, BC和小鼠脾细胞增生的特点, 选择无放射性污染的MTT比色法作为首选检测方案。用BTT检测过程以提高反应灵敏度。结果: 用3mg/L BI1640培养的6×105个小鼠脾细胞在37℃ 含50 mL/L CO2孵箱中共孵育36 h。随后每孔弃100 μL上清, 加入MTT(5g/L) 10μL, 37℃避光孵育4 h使各孔充分形成甲瓒颗粒。每孔加入DMSO 150μL, 经平板振荡器振荡20 min至颗粒完全溶解, 在酶标仪上检测A578值即可。结论: 建立了无污染、 造价低、 可操作性强的BTT比色法 脾细胞增生 B: BC or mice splenocytes, MTT assay ale BALB/c mice ulated by BTT conditions ined in these courses. RESULTS: the ent scheme g/L BI1640(ented L/L FBS in a 96 edium idified incubator L/L CO2, 100 microliter supernatants icroliter MTT (5 g/L) ation of formazan. Aftericroliter DMSO inutes until the formazan ized MTT assay, ination, lople operation, could be used as activity identification of BSO购自天津市光复精细化工研究所。TS1型脱色摇床由江苏海门市麒麟医用仪器厂生产。CO2培养箱为德国Heraeus公司产品。扫描仪为清华紫光公司产品。Multiskan Ascent型酶标仪由芬兰Thermo Labsystems公司生产。 　　1.2 方法 　　1.2.1 摸索最佳铺板的脾细胞数 分别在96孔圆底板中加入如下细胞数（/孔）: 12×105、 6×105、 3×105、 1.5×105和0.75×105, 每一个细胞梯度中均加入BI1640培养[5]。为避免边缘效应的产生, 培养板周围各孔中只加入200 μL无菌PBS[6]。37℃细胞培养箱孵育60h。1200 r/min水平离心机离心10min, 每孔中弃100μL培养上清, 然后加入10μL MTT（5g/L）。37℃避光孵育4h。1200 r/min水平离心机离心10 min, 每孔中弃80 μL培养上清后加入200 μL DMSO。平板振荡器上振荡, 约4 h后孔底结晶颗粒消失, 用酶标仪检测A578值。 　　1.2.2 简化DMSO加入条件 用含100 mL/L FBS的100 μL RPMI1640培养脾细胞。刺激时间结束后, 在每孔中直接加入10 μL MTT（5 g/L）。37℃避光孵育4 h后不弃上清, 分别加入100 μL或150 μL DMSO。振荡溶解20 min, 扫描平板, 酶标仪检测A578值。 　　1.2.3 比较培养液用量对细胞培养的影响 分别用100 μL或200 μL培养液培养BTT的量同上。避光孵育结束后, 分别直接加入100 μL或150 μL DMSO。振荡溶解20 min, 扫描平板, 检测A578值。 　　1.2.4 摸索BTT（5 g/L）。37℃避光孵育4 h后, 每孔中加入150 μL DMSO。震荡溶解20 min, 酶标仪检测A578值; （2）时效关系实验: 为保证各检测时间点刺激结果的可比性, 在同一96孔平底板上, 用3 mg/L BTT检测同（1）。 　 　2 结果 　　2.1 最佳铺板脾细胞数的确定 在96孔圆底培养板中加入不同数量的小鼠脾细胞, 观察BTT后形成的甲瓒（Formazan）颗粒即使震荡4 h, 仍不能完全溶解。复孔间A值误差大, 推测可能为脾细胞在U型板底聚集使得颗粒溶解不彻底。以下实验中改用平底板培养脾细胞, 以减少溶解不彻底造成的误差。 　　图1 最佳脾细胞数的确定（略） 　　Fig 1 Determination of optimal splenocytes numbers 　　2.2 实验体系的优化 在上述反应体系中, 加入DMSO溶解颗粒之前需要吸弃部分培养液, 为了减少由此步操作对实验造成误差的可能性, 在100 μL培养液中直接加入DMSO。结果发现, 100 μL DMSO不足以完全溶解formazan颗粒, 而150 μL DMSO直接加入含100 μL培养液中可完全溶解MTT所形成的formazan