菌产品微生物检测：微生物计数试验.docVIP

2.6.12非无菌产品微生物检测：微生物计数试验 1. 简介 这个实验叙述了从今以后在有氧条件下嗜温性细菌和真菌生长的定量计数要求。 设计这个实验旨在确定药物或制剂是否符合已建立的微生物质量要求规范。当用作上述目的时，可参考下面的说明，包括所取样品的量及以结果的解释。 该方法不适用于将微生物作为有效成分的产品。 可以运用包括自动化方法在内的替代微生物方法。但要求已被证明其等价于药典方法。 2. 通用方法 在拟定的条件下进行试验，拟定的条件旨在避免待测产品的外在微生物污染。采取的避免污染的措施必须不影响任何测试中需要披露的微生物。 如果待测产品具有抗菌活性，尽可能取消或者解除这个活性。如果是用灭活剂，则它的效用和毒性情况必须说明。 3. 计数方法 按照规定使用膜过滤法或者平板计数法。最可能数目法（MPN）是微生物计数法中精密度最差的方法。然而，对于特定的低生物负荷的产品组，可能是最适宜的方法。 方法的选择是基于如产品属性，微生物限度要求等因素进行选择的。 选择的方法必须进行大量的样品检测来判断是否符合规范。并建立其方法的适用性。 4. 促生长实验，计数方法的适用性和阴性对照 4-1. 总则 需建立有样品进行试验的条件下微生物测试的性能状况。 检验条件改变或样品改变时，因影响其测量结果，则应确定其适用性。 4-2. 试验菌株制备 用标准的、稳定的试验菌株悬浮液或者将它们按以下步骤制备。因使用种子批培养保留技术（种子批技术），则用于接种的可用的微生物从原始的第一代开始继代培养不能超过5代。且按照2.6.12.-1表所示将每一批细菌和真菌等试验菌株进行独立培养。 使用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或者pH7.2磷酸缓冲溶液来制备实验所用的菌悬液。对于曲霉孢子菌悬液，可以将0.05%的聚三梨醇酯80加入到缓冲溶液中。且应在2小时或2-8℃条件下24小时内应用。稀释曲霉或者枯草杆菌的新鲜营养细胞悬浮液得到稳定的孢子悬浮液，然后取适宜体积的孢子悬浮液用于试验接种。这个稳定的孢子悬浮液可在2-8℃的条件下，验证时间内 4-3. 阴性对照 为了验证试验条件，使用选择的稀释剂代替供试品进行试验，它不能有微生物生长。第5部分的产品检测中也要有阴性对照。如果阴性对照失败，应进行调查。 4-4. 培养基的促生长 测试每一批制备好的培养基，和由脱水制备或者按成分制备每一批培养基。 按表2.6.12.-1所示，在酪蛋白大豆肉汤培养基和酪蛋白大豆琼脂培养基中接种少量微生物菌种（不超过100个菌落形成单位），且每一种菌都单独使用培养基。在沙氏-葡萄糖琼脂培养基上接种菌种少量微生物菌种（不超过100个菌落形成单位），每一种菌都单独使用培养基。按表2.6.12.-1所示的条件下培养。 对于固体培养基，获得的生长结果不得超过由标准接种而来的计算值的两倍范围。对新制备的菌种，微生物的生长状况应与以前测试过的、经批准的培养基的微生物作比较。对于液体培养基，其与以前测试过的、经批准的培养基比较有清晰可见的微生物生长，那么液体培养基被认为是可试用的。 表2.6.12.-1．试验菌的制备及应用 微生物 实验菌株的制备 促生长 有样品的情况下，微生物计数方法的适用性 总需氧微生物计数 总酵母菌和霉菌的计数 总需氧微生物计数 总酵母菌和霉菌的计数 金黄色葡萄球菌ATCC6538NCIMB9518CIP4.83NBRC13276 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-35℃ 酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基≤100CFU30-35℃ —— 酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃ —— 绿脓假单胞菌ATCC9027NCIMB8626CIP82.118 NBRC13275 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-35℃ 酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基≤100CFU30-35℃ —— 酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃ —— 枯草芽孢杆菌ATCC6633NCIMB8054CIP52.62NBRC3134 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-35℃ 酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基≤100CFU30-35℃ —— 酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃ —— 白色念珠菌ATCC10231NCPF3179IP48.72NBRC1594 沙氏-葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基20-25℃ 酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃ 沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃ 酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃ 沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃