突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用.doc

　　突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用 【摘要】 目的: 研究糖化人突变(HM)CD59作为补体攻膜复合体(MAC)抑制物在糖尿病血管病病理机制中的重要作用。方法: 构建2种HMCD59重组质粒, 转染CHO细胞; FCM、 CD59和糖化HN CD59抗补体活性。ELISA测定30例糖尿病无血管病变组和30例Ⅱ型糖尿病血管病组血清PDGFBB、 VEGF含量。结果: 筛选细胞株表达率分别为59.8%、 53.7%、 54.5%; BCECF释放试验显示糖化前转染突变CD59细胞比较糖化后细胞染料释放率低(Plt;0.01); 而正常CD59细胞比较糖化后细胞染料释放率无统计学意义。 Ⅱ型糖尿病有血管病变组与糖尿病无血管病变组相比, 血清PDGFBB、 VEGF明显增高(Plt;0.01)。结论: 证实HMCD59易糖化抗补体活性下降加速糖尿病血管病的发生 发展 。 【关键词】 CD59; 真核表达; 糖化; 补体; 免疫分子 　　[Abstract] AIM: To investigate the function of human mutant CD59 in diabetic pathology. METHODS: The rebinant PALTERMAX plasmid containing human mutant CD59 cDNA and pcDNA plasmid ediating method. Highly expressed cells etry and CD59 and HNCD59 concentration of PDGFBB and VEGF in 30 patients of typeⅡdiabetes al HNCD59 cells and glycated ones. The serum concentration of PDGFBB and VEGF in patients arkedly increased (Plt;0.01). CONCLUSION: The decrease of glycated restricting plement membrane attack plex results in the accelerating of human vascular proliferate plication of diabetes. 　　[Keyent; immunological molecule 补体调节蛋白CD59通过干扰补体攻膜复合体(membrane attack plex, MAC)的形成, 保护宿主细胞免受补体的攻击。已有报道, MAC刺激内皮细胞释放成纤维细胞生长因子(basic fibroblast groa产品; 彩色蛋白质marker为Gibco产品。Lipfectamine 2000购自InvitrogenTMlife technologies 。PDGFBB、 VEGF试剂盒由美国RD SYSTEMS公司提供。Ⅱ型糖尿病无血管病变组30例, Ⅱ型糖尿病有血管病变组30例, 均符合1997年美国糖尿病学会(ADA)诊断标准。 　　1.2 方法 　　1.2.1 目的基因的选择及引物设计 (1)目的基因的选择: 1号人突变CD59(HM1) 42位(F)氨基酸突变为组氨酸(H)相应密码子CAT(H)取代TTT, 即X37 X38 C39 2)43位(E)氨基酸突变为组氨酸(H)相应密码子CAT(H)取代GAG, 即X37 X38 C39 1/F为5′AAG TGT TGG AAG CAT GAG CAG TGC AAT T3′; HM1/R为5′ATT GCA CTG CTC ATG CTT CCA ACA CTT G3′; HM2/F为5′G TGT TGG AAG TTT CAT CAG TGC AAT TTC3′; HM2/R为 5′GAA ATT GCA CTG ATG AAA CTT CCA ACA C3′。 　　1.2.2 重组PCR定点突变获取目的突变基因 EcoR I单酶切, T4连接酶连接, 构建pALTERMAX突变CD59重组质粒, pALTERMAX结构图(图1), pcDNA结构图均含有氨苄青霉素抗性基因pcDNA 含G418抗性基因。 　　图1 pALTERMAX结构图 　　Fig 1 Construction of pALTERMAX1.2.3 人基因突变CD59重组质粒(pALTERCD59)的扩增及鉴定 pALTERCD59质粒转化大肠杆菌DH5ɑ: 感受态细菌的制备; pALTERCD59质粒转化大肠杆菌DH5ɑ; 阳性菌落的筛选; 碱裂