磷脂酰肌醇3激酶途径在哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用.doc

　　磷脂酰肌醇3激酶途径在哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用 ：吴立琴，戴元荣，夏晓东 【摘要】 　　目的 ：观察哮喘大鼠肺组织中p-Akt、p-p70S6K含量变化，探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号转导途径在哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）增殖中的作用。方法 ：SPF级健康雄性SD大鼠36只，随机分为对照组（C组）、哮喘组（A组）和annin干预组（C增殖。 【关键词】 哮喘 大鼠 气道重塑 信号转导 平滑肌细胞 　　Abstract: Objective: To observe the changes of p-Akt，p-p70S6K in lung tissues of asthma rat and to evaluate the role of phosphoinositide 3-kinase signal patha. Methods: Thirty-six male Sprague-Daly divided into three groups on average， including control group (group C)，asthma group (group A) and annin treated group (group Cs proliferation， plicates that PI3K signal transduction pathportant role in the ASMCs proliferation of asthma. 　　Key a；rat；airodeling；signal transduction；smooth muscle cell 　　哮喘患者的气道重塑主要包括气道平滑肌细胞(airooth muscle cells，ASMC)增生/肥大、基底膜增厚、血管生成等，其中最明显的是ASMC的增生和肥大[1]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）在ASMC增殖中的作用最近有初步阐明，但其是否介导哮喘ASMC增殖尚不明确。我们通过复制大鼠慢性哮喘模型，研究PI3K的下游信号分子Akt、p70S6K活性变化，并予PI3K特异性抑制剂annin干预，探讨PI3K信号途径在哮喘ASMC增殖中的作用。 　　 1 材料和方法 　　1.1 实验动物 SPF级健康雄性Sprague-Daa公司产品，annin为Biomol公司产品，兔抗大鼠磷酸化Akt多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均为美国CST产品，兔抗大鼠p70S6K多克隆抗体、兔抗大鼠磷酸化p70S6K多克隆抗体及兔抗大鼠β-actin多克隆抗体均为Santa Cruz产品。 　　1.3 哮喘大鼠气道重塑模型复制 SPF级雄性健康SD大鼠36只，随机分为3组（n=12），分别为：正常对照组（C组）、哮喘组（A组）以及annin（L，第8天以相同剂量、相同方法加强致敏1次；致敏后第15天开始予1%OVA雾化吸入刺激，每周3次，每次30 min，连续8周。C组则代以生理盐水致敏和激发大鼠；age-Pro plus 6.0医学图像分析软件，在200倍光镜下，每只大鼠挑选3支有完整横断面的中小支气管，参照文献[4]关于气道各层定义寻找标志，测量支气管基底膜周径(Pbm)、支气管总面积（1）、平滑肌内缘内气管面积（2）。 计算 标准化总管壁厚度（，标准化平滑肌厚度（）为（1璚am2）/Pbm[5]。最后计算3个Pbm、数据平均值作为该标本代表值。 　　1.5 Western blot法测定肺组织p-Akt及p-p70S6K 提取细胞总蛋白质，以BCA法进行蛋白定量。按每孔100μg蛋白量加样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离的蛋白转膜至PVDF膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加兔抗大鼠p瑼kt多克隆抗体(1:1 000)或兔抗大鼠β-actin抗体(1:1 000)，于4 ℃过夜。以三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBS）洗膜后加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（1:2 000），于室温孵育1 h，洗膜，用ECL显影。用Quantity One凝胶软件分析系统分析p-Akt蛋白和内参β-actin光密度值，以目的蛋白p-Akt条带光密度和内参β-actin光密度比值代表p-Akt的光密度值。Western Blot检测p-p70S6K蛋白时，一抗孵育分别予兔抗大鼠p70S6K及p-p70S6K多克隆抗体，以p-p70S6K条带光密度和p70S6K光密度比值代表p-p70S6K的光密度值，其余步骤均同p-Akt。 　　1.6 统计学处理方法 组间比较采用单因素方差分析，进行方差齐性检验，方差齐者用LSD，方差不齐者用Dun’s T3法检验。两变量的相关程度用直线相关分析法分析。 　　2.3 各组大鼠肺组织p-Akt蛋