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高效液相色谱法 1 简述 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatographg，HPLC）是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基键合硅胶（又称ODC），可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长的紫外 可见光检测器，其他的检测器有二极管阵列紫外 可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。洗脱分等度洗脱和梯度洗脱二种。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀实现程序控制。 现将检测器分述如下： 1.1紫外检测器（Ultraviolet detector ，UV）紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的检测器，几乎所有的液相色谱仪都配此类检测器，是一种选择性检测器。 工作原理：朗伯－比尔（Lambert－Beer）定律，即当一束单色光透过样品池时，若流动相不吸收光，则吸光度（A）与吸光组分的浓度（C）和样品池的光径长度（L）成正比。 分类：紫外检测器包括固定波长检测器，可变波长检测器和光电二极管阵列检测器三类。 固定波长检测器的波长一般为254nm，以低压汞灯为光源，光源单色性好、光强度大、灵敏度高，适合于大多数芳香族、芳杂环、稠芳环类以及芳香氨基酸、核酸等的检测。 可变波长检测器是目前配置最多的检测器。光路系统类似分光光度计，一般采用氘灯或卤钨灯为光源，光束经单色器分光后按需要选择组分的最大吸收波长为检测波长，从而提高灵敏度。有的还具有双波长比例检测功能，可用于峰纯度检查。 二极管阵列检测器（Diode array detctor，DAD）是20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器。在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相当于一个单色器的出口狭缝，二极管越多分辨率越高，一般是一个二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光。DAD的工作原理是：复色光通过样品池被组分选择性吸收后再进入单色器，照射在二极管阵列装置上，使每个纳米波长的光强度转变为相应的电信号强度，即获得组分的吸收光谱，从而获得特定组分的结构信息，有助于未知组分或复杂组分的结构确定。许多色谱工作站可将两张图谱绘在一张三维坐标图上而获得三维光谱一色谱图，也可进行峰纯度检查。以峰纯度数值说明某个色谱峰的纯度，数值越高，色谱峰为单峰的可能性越大；数值越低，色谱峰为重叠峰的可能性越大，用于指导色谱分离条件的摸索。随着化学计量学的发展，将色谱信息和相对应的光谱信息相结合，按一定的数学模型处理，能解决重叠峰的识别和定量难题。但DAD检测器的灵敏度比通常的UA检测器约低一个数量级。所以单纯用于含量测定或杂质检查时，还是采用UA检测器为好。 优点：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、对流速和温度的波动不灵敏，适用于梯度洗脱及制备色谱。 缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的选择有一定限制，流动相的截止波长必须小于检测波长。 适用范围：大多数有紫外吸收的化合物。 1.2 荧光检测器（Fluorophotometric deteetor，FD） 工作原理：具有某种特殊结构的化合物受到紫外光激发后能发射出比激发光源波长更长的光，称为荧光。荧光强度（F）与激发光强度（I0）及荧光物质浓度（C）成正比。 优点：灵敏度高、选择性好，是微量组分和体内药物分析常用的检测器之一。 缺点：只适用于能够产生荧光的物质的检测，适用范围不如紫外检测器。影响因素较多，对溶剂的纯度、PH值、样品浓度、检测温度等需很好地控制。 适用范围：具有天然荧光的物质可以直接检测，也可通过荧光衍生化使原本没有荧光的物质转变成荧光衍生物后测定，从而扩大了荧光检测器的适用范围。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。 1.3 电化学检测器（Electrochemical detect，ECD）：电化学检测器是测量物质的电信号变化，对具有氧化还原性质的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、