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CTAB法提植物基因组
CTAB法提取植物基因组DNA
作者：未知 来源：生物秀 时间：2006-8-31
实验仪器大全 实验试剂大全
这种方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 CTAB为十六烷基三甲基溴化铵， CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中； Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。 CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。 一 材料、试剂和仪器 1 材料 新鲜的组织材料或-80冻存的材料 2 试剂 (1)2×CTAB溶液
(2)氯仿/异戊醇（24:1） (3)RNaseA 10mg/ml (4)乙醇或异丙醇 (5)β-巯基乙醇 （6）氯仿/异戊醇（25/24/1） （7）70%乙醇 3. 仪器: 离心机， 恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置 二、实验程序 1.在2mL离心管中，加入500μl的2×CTAB和20 μlβ-巯基乙醇, 65预热。 2嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。 注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。 3加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。 4向管中加入1/100体积的RNase A溶液，置3720-30min。 5加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20放置30 min或-80放置10min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。 6 用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。 7 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。
DNA?提取试剂配制
(2011-08-17 22:48:18)
1000ml CTAB溶液配方： CTAB:2g Tris-HCL(1M PH8.0):10ml EDTA(0.5M PH8.0):10ml NaCL:8.2g ddH2O:74.4ml b-巯基乙醇：5.6ml PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：0.5g??????? 10%SDS 在90ML 双蒸水中加入10gSDS, 加热到68℃助溶，加Hcl调PH至7.2，定容至100ML;
??????? 5mol/L Nacl? 在80ml双蒸水中加入29.25g Nacl, 定容至100ml;
??????? 10%CTAB?? 加12.11克Tris碱、7克NaCl、7.464克EDTA-Na2、20克CTAB，加约900毫升去离子水或双蒸水,用盐酸分析纯调pH至8.0，后定容至200ML;
??????? 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1） 苯酚100ml：氯仿96ml:异戊醇4ml
?????? 氯仿：异戊醇（24:1）? 氯仿120ml: 异戊醇5ml
??????? 3mol/L NaAc?? 取24.6g NaAc溶于100ml双蒸水
??????? 70%乙醇 无水乙醇70ml, 双蒸水30ml???????? 1×TE（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 ；1 mM EDTA，pH 8.0）的配制：1 M Tris-HCl（pH 8.0）： 1 ml? ；0.5 M EDTA（pH 8.0）： 0.2 ml，超纯水至 100 ml；
???????? 10mg/ml RNaseA? 将胰RNaseA10mM Tris-Hcl（pH7.5）,15mM? Nacl溶液中，浓度10mg/ml,于100℃水浴处理15min以降解DNA酶，缓慢冷却室温，-20℃保存；
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