Protocol蛋白质纯化步骤.docVIP

Protocol 蛋白质纯化方法（镍柱） 柱前操作 IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min; 用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质； 取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体； 用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？ 用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）； 对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱； 平衡柱子（柱体积：V） 7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）； 8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？ 9. 3V BB; 柱层析 上样； 10V Washing Buffer（WB）； 6V Elute Buffer（EB); 分管收集，每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素：60.06×6=360.36g Ni柱纯化蛋白注意事项 (2011-10-13 16:01:39) 使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师姐那里获得的。这些经验都是大家智慧的结晶。同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪里掌握呢？ 给大家推荐一个办法，那就是参考那些大公司的实验手册。一般像GE、Qiagen等知名公司，都有Ni柱柱材料的产品，因此关于柱材料的各种性质参数，以及使用方法和注意事项都有详细的说明。 下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考。 1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等；2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解； 6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染； 一?非变性条件下抽提His-Tag蛋白质??? 下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His Tag Protein） 的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（Native Protein）。其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol）和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓