芯片构建与阅读.docVIP

芯片的构建和阅读 Vivian G. Cheung, Michael Morley, Francisco Aguilar, Aldo Massimi, Raju Kucherlapati Geoffrey Childs 联合基因科技有限公司 吴凌凌 译 　　摘要 　　制作芯片和获得芯片的数据有许多不同的方法。这里我们介绍了在学术领域中两种芯片的构建和使用。除了详细说明了技术细节外，我们还对组成和方法的优缺点进行了评论，同时还介绍了杂交的方法。用我们所建立和使用芯片的方法来回答生物领域问题的事实证明了这种技术在大学的环境下是可行的。 　　一种获得基因功能信息的高通量的方法是cDNA芯片。在一块显微镜载玻片上包含了几百至几千个固定的DNA样本，以类似于Northern blot 和 Southern blot的方法进行杂交。了解了这个方法后，我们决定在我们各自的实验室Pennsylvania大学（Penn）和Albert Einstein学院医学部（AECOM）制作了高速，高精度的芯片。这个设备是由Stanford医学院Pat Brown制造的，第一次论证了这个方法的可行性。我们的目标是（1）最终以合理的价格，用一块或几块芯片来检测哺乳动物细胞中每个基因的表达，（2）发展以芯片为基础的绘图方法，（3）兼顾硬件和超作方法，尽可能地提高灵敏度。 　　玻片的优势 　　一个理想化的支持物允许探针有效地固定在其表面，探针与目标分子能牢固地杂交结合。与另一种用于制作芯片的标准支持物尼龙一样，玻璃有许多的优点。它也有其特长。首先，DNA样品以共价键的形式结合在处理过的玻片上。第二，玻璃是一种耐用的材料，能够耐高温和高离子强度溶液的洗涤。第三，玻璃不是多孔材料，使杂交的容量能保持在最小，因此能提高探针与目标分子的退火效率。第四，由于材料的低荧光性，不会有背景的影响。最后，两种不同的探针能够标上两种不同的荧光标记，在一片芯片上同一个反应中同时孵育；尼龙就受到连续或平行杂交的限制。 　　芯片需要大量的探针固定（或排列）在玻片上，这里我们描述了AECOM芯片，扫描仪以及进行了关于设计和操作的讨论。如果想得到关于Penn芯片的信息，请到 HYPERLINK /vcheung /vcheung查找。 　　自动化装置性质 　　AECOM点样仪，Albert，产生高密度的分隔的矩阵，矩阵包括cDNA、基因组DNA或其他类似的生物物质。机械的基本组成有计算机控制的三轴向的机械手和独特笔尖装置。 　　设计特点 　　机械手被设计成能自动从96或384孔的微量滴定板中选取样本，12支点样笔同时升起，每个点样笔收集了250-500nl溶液，在每块玻片上放置0.25-1nl，产生的点的大小范围直径为100-150μm。机械手是由设置好的程序控制的，能进行连续的点样，每一点避免与相邻的点接触，每点的中心距离大约为200-250μm。检测的精密度大约是10μm。机械手放置在可视工作平台上（Newport公司），允许放置大量的显微镜玻片，微量滴定板，三个洗涤装置和一个干燥装置。 　　洗涤装置是个固定的容器，装有蒸馏水，两次微量滴定板使用后需要更换。当笔尖浸过液体后，机械手要来回摇动点样笔（大约5Hz）来增加清洁程度。虽然我们认为没必要，但电脑控制的洗涤液可用超声波或流动的水来替代。干燥装置实际上是干/湿真空吸尘器（Sear公司，美国），接头与插入笔尖的限制插口相匹配。干燥器要做到在笔尖有快速流动的空气围绕，保持局部真空。 　　所设计的机械手的重要目的是要达到在最小的震动范围内的高速和高精确性。我们使用了保湿的可视工作平台，精密螺旋驱动地机械滑动，高分辨率的解码器的随动系统和沿着x轴方向的两侧支杆，避免了在一些系统中所见的悬臂结构。利用第二x轴的滑面来增加系统的固定性，能依次产生更快的定位以及通过工作平台的准确一致性。这些特点允许在精确率下的快速运动，使机械手能在一秒内对两块显微镜载玻片操作。 　　带有笔尖的点样笔支持物装置是一个重要的部分。我们的设计结合了线形运动，控制点样笔的方向，允许在最小的阻力下精确地纵轴运动，以防止在其他方向上的错位。我们设计的另一个独特之处是可调整的末端丝，允许在10μm的范围内校直每个点样笔的轴，以保证所有12支笔尖能在同一时间内接触显微镜玻片。而另一个没有这特点的设计需要与点样笔的精确长度一致以适应多点样笔的操作。每个点样笔由低强度的弹簧作为支持，保证在未接触表面时能回到伸展的位置。笔尖是由直径大约为1.6mm的不锈钢材料逐渐处理变细直至每点直径为100μm。再沿着中心垂直切割，在尖端分成两部分，每部部分5μm。 　　这个系统由可视基础程序控制的，在Microsoft Windous