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不同方法测定酱油成曲蛋白酶活力中图分类号：TQ925+.2文献标识码：A 文章编号： 成曲蛋白酶活力是酱油生产过程中的一项关键控制指标，是影响酱油质量的重要因素，可见成曲蛋白酶活力的检测显得非常重要，通过多年的实践，对国家不同检测标准方法的试验、总结得出简单实用的检测方法： 材料与方法 试验材料 某品牌酱油成曲。 试验仪器 水浴锅8002型（北京永光明医疗仪器厂） 电子万用炉（北京永光明医疗仪器厂） 722S分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) 酸度计 雷磁PHS-3C (上海精密科学仪器有限公司) 天平 ALC AccuLAB 快速水份测定仪 SC69-02C (上海第二天平仪器厂) 酸度计 雷磁PHS-3C (上海精密科学仪器有限公司) 试验耗材 1mL、2 mL、5 mL、10 mL、20 mL胖肚吸管，1mL、2 mL刻度吸管，50 mL、100 mL容量瓶，100 mL量筒，150 mL烧杯，直径15×150mm试管，直径20×200mm试管，漏斗，滤纸，三角烧瓶等。 1.4试验方法 1.4.1福林法 1.4.1.1试剂 ⑴ 0.1mol PH7.2磷酸缓冲液 ⑵ 0.4mol三氯醋酸溶液 ⑶ 0.4mol碳酸钠溶液 ⑷ 2%酪蛋白溶液 ⑸ 100微克/mL酪氨酸溶液 ⑹ 福林试剂(稀释1:2) 1.4.1.2福林试剂标准曲线的绘制： 按下表配成各种不同浓度的酪氨酸溶液 试 (1)测定步骤： 取6支试管按上表编号分别吸取不同浓度酪氨酸1mL，各加入0.4mol碳酸钠溶液5 mL. 福林试剂(稀释1:2) 1mL摇匀.置于40℃水浴中保温发色20分钟.在722S分光光度计上分别测定光密度波长660nm取其平均值。将2-6管号所测得的光密度(O.D)为实际O.D值. 不同浓度标准管比色结果 (2)曲线绘制 以实际O.D值为纵坐标,酪氨酸浓度为横坐标。绘制成标准曲线 由标准曲线求出K值。 K= 式中：K ——每OD值相当的酪氨酸含量（ug/mL）; 酪氨酸浓度之和; 光密度(O.D)之和. 1.4.1.3检测方法： (1)水份的测定 用快速水分测定仪进行水份的测定,测得水粉含量为25%。 (2)蛋白酶活力的测定 a) 样品稀释液的制备 称取充分研细后的成曲5克, 加100mL40℃的自来水, 在40℃水浴锅内水浴1小时(间断搅拌), 过滤，滤液备用。吸取10 mL 滤液于50mL容量瓶中，用0.1mol PH7.2磷酸缓冲液定容至刻度。 b)样品的测定 取直径15×150mm试管5支，编号1.2.3.4.5.每管内加入样品稀释液1mL，置于40℃水浴中预热2分钟，再各加入经同样预热的2%酪蛋白溶液1mL精确保温10分钟，立即再各加以终止反应，继续置于水浴中保温20分钟使残余蛋白质沉淀后滤纸过滤 另取直径15×150mm试管5支，编号1.2.3.4.5.每管内加入上述滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠溶液5 mL 福林试剂(稀释1:2) 1mL摇匀，保温发色20分钟后进行光密度（O.D）测定. c)空白的测定 取直径15×150mm试管5支，编号1.2.3.4.5.每管内加入样品稀释液1mL，置于40℃水浴中预热2分钟，再各加入0.4mol三氯醋酸溶液2mL使酶失活，精确保温10分钟各加入经同样预热的2%酪蛋白溶液1mL, 继续置于水浴中保温20分钟使残余蛋白质沉淀后滤纸过滤 另取直径15×150mm试管5支，编号1.2.3.4.5.每管内加入上述滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠溶液5 mL 福林试剂(稀释1:2) 1mL摇匀，保温发色20分钟后进行光密度（O.D）测定. d)计算 在40℃下每分钟水解干酪素产生1微克酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位 蛋白酶活力单位=样品OD值×K××N× 式中K－每OD值相当的酪氨酸含量（ug/mL）; N－成曲酶的稀释倍数; 4－4mL反应液取1mL测定; 10－反应10分钟. 1.4.2甲醛法 1.4.2.1试剂 (1)0.0565mol氢氧化钠 (2)甲醛溶液 (3)1%酚酞 1.4.2.2检测方法 (1)水份的测定 用快速水分测定仪进行水份的测定,测得水粉含量为25%。 （2） 空白测定： 称取充分研细后的成曲2.5克, 于直径20×200mm试管中加入55℃的水20mL,煮沸后置于5