DNMT3B基因异常表达与肝癌发生的相关性研究.pdfVIP

临床检验杂志2008年第26卷第1期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Science，2008，Vo1．26，No．1 27 文章编号：1001_764x(2008)01枷27一D4 中图分类号：Q786 文献标识码：A ·实验研究 · DNMT3 B基因异常表达与肝癌发生的相关性研究 单云峰 ，樊红 ，赵主江 ，许军 ，程欲超 ，权艳梅 ，谢维 (1．东南大学发育与疾病相关基因教育部重点实验室，南 京210009；2．江苏省疾病预防控制中心微生物检验科，南京210009) 摘要：目的 探讨DNMT3B和肝癌发生的关系。方法 用实时荧光定量RT—PCR方法分析正常肝细胞系、肝癌癌旁细胞系及 肝癌癌细胞系中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达谱，以及DNMT3B表达抑制后在肝癌细胞系SMMC-7721中出现表达上调 的与肿瘤发生相关的基因PDCD4和MBD3的表达。结果 DNMT1，DNMT3A，DNMT3B在肝癌细胞系中存在高表达的趋势， 表达水平一致性的明显高于肝癌癌旁和正常肝细胞系，提示这些酶与肝癌的发生相关。结论 DNMT3B表达抑制后肝癌细胞 系SMMC-7721中与肝癌发生相关的MBD3和PDCD4基因表达水平上调，表明DNMT3B沉默后，诱导了下游肿瘤抑制基因的 过表达，推测DNMT3B在肝癌发生中通过某种机制调控下游肿瘤抑制基因的表达。 关键词：DNA甲基转移酶3B；肝癌；实时荧光定量RT—PCR 肿瘤的抑癌基因沉默为肿瘤发生原因之一。启 胞系。 动子区高甲基化将导致抑癌基因转录失活而引起沉 1．2 总RNA的抽提 取培养细胞2 x 10 个，常规 默，此现象广泛地存在于多种恶性肿瘤中…。DNA TriZol法提取总RNA，RNA用分光光度计定量，以 甲基化是真核生物基因表达调控的一种方式，催化 10 g／L琼脂糖凝胶电泳检测。 这一过程的是DNA甲基转移酶(DNA—methyhrans— 1．3 cDNA第一链的合成 每个总RNA样品取4 ferases，DNMTs)。DNMTs分为 DNMT1，DNMT2， g，加入 12．15 l的 DEPC水，50 p~mol／L oligo DNMT 3家族，在哺乳动物中，DNMT3在DNA甲基 (dT18)3．5 l，70℃5 min，0℃5 min加入40 U／txl 化中起主要催化作用 J。DNMT3又分为DNMT3A 的RNase抑制剂 0．5 l，5×RT buffer 5 l，10 和DNMT3B，后者在各种癌症中都是高表达并在癌 mmoL／L dNTP 1．25 tzl，200 U／txl的M．MLV逆转录 症发生发展中起重要作用 J。本研究用实时荧光 酶(Promega公司)1 tzl，42℃反应1 h，95℃加热5 定量RT．PCR检测了DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在 min后，一20℃保存备用。 正常肝细胞系、肝癌癌旁细胞系及肝癌癌细胞系中 1．4 引物的设计及合成 DNMT3A、DNMT1、DN— 的表达水平，并探讨DNMT3B与肝癌发生发展的关 MT3B、MBD3的引物序列及反应条件见文献Ⅲ5 。 ， 系以及DNMT3B表达抑制对下游基因的影响。 根据PDCD4基因序列 (GeneBank NM_014456)，用 1 材料和方法 Primer Express Software V2．0设计PDCD4的引物， 1．1 材料 细胞系购自上海细胞所，正常肝细胞 引物序列及拟扩增片段序列送至NCBI BLAST数据 系：HL．7702；肝癌癌旁细胞系：QSG-7701；肝癌细胞 库检测特异性。基因引物序列及反应条件见表1。 系：BEL-7402，BEL-7404，BEL-7405，HepG一2，QGY一 引物由上海英骏公司合成。 7703，QGY-7701，SMMC-7721。用 RNAi方法抑制 1．5 实时荧光定量RT—PCR DNMT3B表达的细胞系并分别命名为@7721一pSU— 1．5．1 标准曲线的绘制 目的基因行RT—