转化生长因子β1诱导A549细胞向间充质细胞转化的作用研究.docVIP

　　转化生长因子β1诱导A549细胞向间充质细胞转化的作用研究 ：郑金旭， 张小燕， 端礼荣， 陈炜， 管淑红 【摘要】 目的： 观察重组人转化生长因子β1(rhTGFβ1)对人肺上皮细胞株(A549)的转化作用。方法： 将体外培养的A549用不同浓度的rhTGFβ1干预后，倒置显微镜观察细胞形态学的变化，用MTT法检测rhTGFβ1对A549增殖的影响。48 h收集蛋白用蛋白质印迹和间接免疫化学方法检测间充质细胞表型FibronectinEDA（FnEDA）表达变化。结果： rhTGFβ1诱导A549向间充质细胞形态转化，在体外对A549增殖无明显影响，上调间充质细胞表型FnEDA 表达。结论： rhTGFβ1可诱导A549发生上皮细胞-间质转化(ephethlialmesenchymal transition,EMT)，支持肺上皮细胞发生EMT的观点。 【关键词】 转化生长因子β1； 人肺上皮细胞株(A549)； 上皮细胞-间质转化 　　［Abstract］ Objective: This experiment an tranfoming groan alveolar epithelial cells.Methods： Cultured A549 cells orphology change observed under phasecontrast microscopy; the effect of proliferation of A549 e inmmuohistorchemitery(IEI). Results： The data shoorphological alteration from alveolar epithelial to mesenchymal， ineffected esenchymal phenotype FibronectinEDA marker. Conclusion： Our study shoesenchymal transition(EMT). 　　［Key ing groan alveolar epithelial cells lines(A549); ephethlialmesenchymal transition 　　特发性肺纤维化(IPF)是一种病因不明的常见致命性间质性肺病，病理改变表现为间质炎症、纤维化和蜂窝肺改变，与正常肺组织呈灶状交替出现［1］。近年来发病率有明显增高的趋势，临床缺乏有效的 治疗 手段。 　　随着对IPF发病机制的深入研究，发现肺纤维化病灶内增生的肌成纤维细胞(MFb) 除于肺内固有的间充质细胞外,纤维化病灶内肺泡Ⅱ型上皮细胞可能通过上皮细胞-间质转化(ephethlialmesenchymal transition,EMT) 而成为MFb 的另一主要，而TGFβ1在EMT过程中发挥关键作用［2］。EMT是指上皮细胞失去其特有的表型，获得新的表型，转化为间质细胞的过程。其特点是上皮细胞发生了形态和表型改变，产生胶原，导致器官的纤维化。 　　A549具有Ⅱ型肺泡上皮的重要特征［3］，我们以A549细胞为研究对象，观察TGFβ1对A549细胞形态学变化和增殖作用，以及对其间充质标志物FnEDA蛋白表达的影响，进一步探讨IPF发病过程中肺上皮细胞发生EMT的可能过程。 　　1 材料和方法 　　1.1 材 料 　　细胞：A549细胞(购自 中国 科学 院细胞库)。rhTGFβ1（购自RD公司），小鼠抗人FnEDA 单克隆抗体（购自Abcam公司），FITC标志的羊抗小鼠IgG、辣根酶标记羊抗小鼠IgG(均购自武汉博士德生物工程有限公司）,MTT(购自南京大冶生物科技有限公司)。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 细胞培养［4］ A549用含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml庆大霉素,低糖-DMEM培养基，常规培养于5%的CO2,37℃ 人工培养箱中,培养至细胞融合70%～80%，用无血清培养基饥饿24 h，随机把细胞分组，在无血清培养基中加入rhTGFβ1，按实验要求分组。 　　1.2.2 细胞形态学观察 将A549细胞1×105传代于50 ml培养瓶中,换无血清培养基培养过夜,加入不同浓度的TGFβ1（1, 5,10 ng/ml）培养48 h, 相差显微镜下观察细胞形态的变化并拍照。 　　1.2.3 MTT比色法 用0.25%胰酶消化细胞配成细胞悬液，以每孔1 000～5 000细胞数接种于96孔板，每孔体积200 μl，培养细胞24 h,换成无血清培养基饥饿过夜，加入不同浓度的rhTGFβ1（1.0, 5.0,10.0 ng/ml ），并设空白对照组，