何水林版基因工程第四章-基因操作过程-教学版.pptVIP

第四章　基因操作过程　;转化子的筛选和鉴定（检）;;第一节　DNA的体外重组;亚克隆：把DNA片段从某一类型的载体无性克隆繁殖支另一类型的载体的过程。;理想的酶切位点应当符合下列几个条件; 外源DNA与载体的连接方法;1　黏性末端连接法;同种内切酶生产的粘性末端的连接;同尾酶生产的粘性末端的连接;单酶切位点黏性末端连接法的缺点;双酶切片段的定向克隆;双酶切片段的定向克隆的优点;不同粘性末端的连接;从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括： ;平末端的连接的优点;3　人工接头连接法;粘性末端的更换;4　同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接法;人工粘性末端的连接 5′突出末端;人工粘性末端的连接 3′突出末端;人工粘性末端的连接 平头末端;同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法 主要优点;5　重组率;提高重组率的方法;提高重组率的方法;第二节　重组体导入;1 用于基因转移的受体菌或细胞;1.1　受体细胞应具备的条件;1.2　各种基因工程受体的特性;枯草杆菌;链霉菌;酵母菌;昆虫细胞（家蚕）;哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO） ;植物细胞（拟南芥、烟叶） ;拟南芥（Arabidopsis thaliana）;拟南芥是进行遗传学研究的好材料 被科学家誉为“植物中的果蝇”;1.3　实验室常用的基因工程受体;克隆与导入方法： 转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体菌细胞遗传性状发生改变 转染：携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法 电转化：受体细胞施加短暂的高压电流，其质膜上形成微孔，外源DNA通过微孔进入宿主细胞 基因枪法：利用压缩气体动力，产生的冷气体冲击波进入轰击室，把粘有DNA的金粉打向细胞核。 微注射法：将外源基因直接注射到真核受体细胞内转化酵母菌 植物细胞的叶盘法基因转移;2.1　转化（transformation）;pUC18质粒 ;用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时 ;挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 ;加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2，悬浮沉淀，即可使用。 也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存 ;外源DNA的转化;37℃培养9～16h;利用成品感受态细菌转化;在Selektionsplatten (LB/Amp/IPTG/X-Gal)?上生长的是转化子;同时做两个对照:;以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落;　 ②电穿孔转化;将细菌溶于1～2ml 10%的甘油中，以40～80μl/管分装 -70℃冻存，备用;将脉冲电击转化仪打开，调电压为1.8KV 从-70℃取出保存的感受态细胞，解冻后置于冰上 每管感受态细胞加入1μl 连接产物,转移到电击杯中 电击，然后迅速向电击杯中加入1ml液体LB培养基 将电击后的菌液转移至1.5ml Eppendorf管， 37℃恒温摇床培养1h 铺100μl于含X-gal和IPTG的Amp平板 37℃恒温培养箱培养9－16h ;2510电转仪，适用于原核细胞;In vitro packaging and transfection;l噬菌体DNA的转染;3　转化率;如：pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4×1011个分子（6.02×1017 / 2686×660），即每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 　另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2×1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA ;转化率的用途;转化率的影响因素;受体细胞方面： ;转化方法方面： ;4　转化细胞的扩增;扩增操作;第三节　重组子的筛选; 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子;1　遗传检测法;抗药性筛选法;抗药性筛选法;显色筛选法;1.2　营养缺陷型筛选法;常见的营养缺陷型筛选标记： ;2　依赖重组子结构特征的筛选法;②　限制性酶切图谱法;3　核酸杂交法;3.1　探针及制备 ;寡核苷酸探针（oligonucleotid probe）：是人工合成且被适当标记的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的DNA或RNA），能与被检测长链DNA或RNA进行分子杂交，且杂交后