免疫细胞的分离及功能测定.ppt

免疫细胞的分离与功能测定 一 外周血单个核细胞的分离 原理: 密度梯度离心， 利用密度为1.077±0.001g/L 淋巴细胞分层液（聚蔗糖-泛影葡胺） 主要步骤 1 无菌采集静脉血，抗凝（每1ml全血加0.1ml 125～250U /ml 肝素溶液） 2 用等体积Hanks平衡盐溶液(HBSS)或pH7.2～7.4 PBS 稀释 3 按每10ml稀释血用3～5ml淋巴细胞分层液的比例先将淋巴细胞分层液加入离心管中，再小心沿管壁缓慢加入稀释血，注意切勿使血液混入分层液 4 2000r/min 水平离心30min， 5 吸取分层液与血浆交界部位的单个核细胞，用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次依次以2000 r/min，1500 r/min离心10min 6 用完全RPMI-1640定容，计数。一般每ml健康成人血可分离出1×106～2×106单个核细胞 7 台盼蓝染色，检查细胞活性，活细胞应﹥95﹪。 注意事项 1 严格无菌操作 2 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀 3 淋巴细胞分层液应4℃避光保存，取出后待温度升至室温使用 4 如须保存血浆作他用，则不能稀释血液 5 离心最适温度18～20℃ 6 分离组织中的单个核细胞也可采用上法 二 淋巴细胞的纯化 ㈠红细胞的去除 1 低渗裂解法 1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇（﹤1min） 立即加入1.8﹪NaCl, 洗涤 2 氯化铵处理法 沉淀的PBMC中加入1ml 0.83﹪氯化铵溶液，轻摇2 min，洗涤 ㈡血小板的去除 1 .PBMC经洗涤2～3次可去除大部分血小板 2 .胎牛血清(FCS)梯度离心 1ml PBMC悬液（1×107～2×107/ml）用3ml FCS 800r/min 水平离心15min，18～20℃ ㈢单核细胞的去除 1 .粘附去除法 原理 单核细胞可粘附在玻璃或塑料表面 ⑴PBMC用完全RPMI-1640调整浓度至2×106/ml ⑵将50ml细胞悬液移入150cm2培养瓶，37℃ 5﹪CO2 95﹪湿度培养1h ⑶收集非粘附细胞，再用预温至37℃的RPMI-1640 ,轻轻荡洗培养瓶并收集荡洗液 ⑷1300r/min 离心10 min，18～20℃ ⑸弃上清，用5～10ml完全RPMI-1640悬浮细胞计数，用台盼蓝染色检查细胞活性 2. L-亮氨酸甲酯去除法 溶酶体酶→L-亮氨酸甲酯 →L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯 此法也可清楚NK细胞和细胞毒性T细胞 本法只适用于分离新鲜细胞 ⑴用PBS调整细胞浓度至3×1065×106/ml，用无血清RPMI-1640配制10mmol/L的L-亮氨酸甲酯溶液（临用时配），两液按1︰1比例混合，室温40min ⑵1300r/min 离心10 min，用HBSS或PBS洗涤沉淀共3次 ⑶用完全RPMI-1640悬浮细胞，用无菌尼龙网过滤，离心并计数，调整细胞至所需浓度 3. 羰基铁吞噬离心法 在抗凝血中加入一定量羰基铁粉，37℃搅拌15 min，然后用淋巴细胞分层液离心分离 亦可先分离PBMC，再加羰基铁粉分离去除单核细胞 粘附法去除单核细胞后，大约95﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪ L-亮氨酸甲酯法，99﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪ 三 外周血淋巴细胞选择性分离 ㈠ T细胞的分离 1 .尼龙棉柱法 原理 B细胞易粘附于尼龙棉纤维，而T细胞则否 尼龙棉（聚酰胺纤维）预处理 尼龙棉（聚酰胺纤维）50mg在0.2mol/L HCl浸泡过夜，用大量蒸溜水漂洗，晾干。 尼龙棉柱制备 塑料软管 长12～16cm 内经5～6mm 壁厚0.2 mm高6cm的尼龙棉柱可有效地滤过20×106～30×106个细胞.此法分离的T细胞纯度可达90﹪以上 2 .花环形成分离法 原理 T细胞表面有绵羊红细胞受体，可与绵羊红细 胞结合形成花环. 绵羊红细胞用2-氨基乙基异硫脲溴化物（AET）或神经氨酸酶（NM）可提高花环形成的效果和稳定性 ⑴1ml PBMC悬液(1×107/ml)、2ml NCS和 1ml 4﹪AET-SRBC悬液混匀，37℃水浴10 min ↓ 800r/min 4℃离心5 min，冰浴1h 或 800r/min 室温离心10 min，4℃2h ↓ 置淋巴细胞分层液（3～5ml分层液可分离10mlPBMC/NCS/AET-SRBC混合液） ↓ 1300r/min 离心25 min，18～20℃ 或 2000r/min 离心35 min，4℃ 位于界面的是非花环形成细胞，沉淀的是花环形成细胞 ⑵1ml PBMC悬液(1×107/ml)、2ml NCS和 2ml 2﹪NM-SRBC悬液混匀，37℃水浴10 mi