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本实验将探究抗肿瘤药物中的顺铂和阿霉素对细胞增殖与凋亡的影响。1.材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞株 人胃癌BGC-823细胞为本实验室常规保存的细胞，于37℃、5％co2培养箱中培养。1.1.2 主要试剂 顺铂（母液浓度5mg/ml），阿霉素（母液浓度5mg/ml），4℃冷藏。四甲基偶氮唑盐（MTT，母液浓度5mg/ml）液，避光保存。还有DMSO培养液，胰酶，胎牛血清，DMEM培养基，裂解液（0.01MHCI，10%SDS），PBS，PI染液，Hoechests-33342染液。1.1.3 主要仪器用具 荧光显微镜，CO2培养箱，离心机，酶标测定仪，冰箱，计数器，排枪，96孔板，酒精灯等。1.2方法1.2.1 原理概述细胞增殖的检测方法很多，本实验选用的MTT检测法是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法。其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使黄色的外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，生成的甲瓒量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。其优点是简单、快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验，肿瘤放射敏感性实验分析。IC50是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。在MTT法中, 就是以对照组吸光度OD 值减少一半所需的药物浓度为IC50。除此以外, 半数抑制浓度的含义还相当于药物对培养细胞的最小致死剂量的平均值, 作为反映药效的定量指标, 在各种药物的筛选中广泛应用。本实验将以此法测定药物对细胞增殖抑制的IC50值所对应的药物浓度。检测细胞凋亡的方法也有很多。根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。本实验选用的Hoechests-PI双染色法是常用的形态学观察法之一。一般可依细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。利用Hoechests-PI双染色法观察细胞核的变化，其中PI(碘化丙啶)是定量细胞化学的荧光染料,能插入双链DNA和RNA的碱基对之间;每隔5个碱基插入一个PI分子。经RNA酶消化后与DNA特异结合。以特定波长激发,可发射出红色荧光。核酸分子越大，则插入的PI分子越多，荧光强度越大。Hoechests是非嵌入式的特异结合DNA的活性染料，主要结合于DNA的AT碱基对，可进入活细胞。用于细胞周期的研究、染色体和细胞核的观察，紫外激发可以发出明亮的蓝色荧光。1.2.2 MTT法观测药物对细胞增殖影响接种细胞：取对数生长期的BGC-823细胞，用胰酶消化计后用培养液配制成细胞悬液（浓度约4×104/mL），取细胞接种到96孔板中，每孔200 μ L（即8000细胞/孔）。其中A1只加培养基。于37℃、5％co2培养箱中培养；加药处理：用DMSO稀释顺铂，用水稀释阿霉素，待细胞贴壁后，弃掉培养基换相应浓度的药液处理，培养箱中作用48小时；MTT法测定量效曲线：取测定孔，弃去培养基，加100μL新鲜的培养基，加12μL MTT，在37℃、5％co2培养箱中孵育4小时后，加100μL裂解液。37℃、5％co2培养箱中孵育过夜，用酶标仪测定OD570值。作细胞的量效曲线，计算出半数抑制浓度（IC50）。 1.2.3 药物试验浓度的确定 顺铂和阿霉素均设置1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml5个浓度组，每组设6个复孔，以MTT法测定细胞活力率，并以计算得出的IC50作为细胞核形态观察施药的工作浓度。1.2.4 Hoechests-PI双染色法观察细胞核形态的变化取生长到80-90%融汇度，对数生长期的细胞，按1：4比例传代，取1瓶细胞传到4瓶；第二天在确定了药物的半数抑制浓度（IC50）后，设置2个未加药对照，加入与药液等体积的DMSO或双蒸水；设置2个加药实验组分别向瓶中加入相应的浓度接近半数抑制率（IC50）的药物，即终浓度2.36ug/ml的顺铂和终浓度2.04ug/ml的阿霉素。37℃、5％co2培养箱中培养72小时后，收集药物处理的细胞和对照组细胞培养液，用胰酶适度消化细胞，用收集的培液吹打细胞，将分散成单个的细胞悬液收集至10mL离心管中，1000rpm离心15min，去上清，用0.2毫升PBS重悬细胞。取178μLPBS细胞悬液，加入PI染液20μL（终浓度100μg/ml），Ho.33342染液2