不均一pcr克隆基因的流程及分子生物学的一些基本操作.docVIP

LB培养基 液态培养基 根据《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔著）配制每升培养基,应该在950 ml去离子水中加入: 　胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 　氯化钠(NaCl) 10g/L 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi（121℃）高压下蒸汽灭菌20min. （1.05kg/cm3） 150ml的配方如下： 胰蛋白胨(Tryptone) 1.5g/L 酵母提取物(Yeast extract) 0.75g/L 氯化钠(NaCl) 1.5g/L 固态培养基 LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。 LB固体培养基倒板 1.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉 2.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 3.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。 4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。 抗生素终浓度Amp 100ug/ml,Kan 50ug/ml. LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求.培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌.通过培养工程菌,我们可以表达大量的外源蛋白,也可以拿到带有外源基因的质粒,工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础. 一、大肠杆菌质粒DNA的提取 　　质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法： 　　碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 　　1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 　　2、37振荡培养过夜。 　　3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 　　4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合　　5、加入0.2ml溶液 II（0. M/L NaOH，％ SDS），轻轻翻转混匀　　6、加入0.15m1预冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min . 　　7、以1，000rpm离心0min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀12，000rpm离心min，将上清液另一新Ep管9、加入等体积的异戊醇，混匀12，000rpm离心min，将上清液另一新Ep管10、加入体积的，混匀12，000rpm离心min，弃上清。 11、12，000rpm离心min，弃上清，于空气中干燥（超净台上开大风干燥）或真空干燥。 12..待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中　　煮沸法 　　1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4下12000g离心30秒。 　　2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 　　3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中， 涡旋混匀。 　　4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）， 涡旋振荡3秒钟。 　　5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。 　　6、用微量离心机4下12000g离心10分钟。 　　7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 　　8、取20ml进行电泳检查。 　　[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA. 　　2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。 3. 提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。　　质粒DNA的大量提取和纯化 　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA，为此需要大量提取质粒DNA.大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 　　（一）碱法 　　1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4下5000g离心15分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。 　　2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。 　　3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。 　　4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中，充