关于抗菌材料的实验设计-杨茜.docVIP

根据上海市第九人民医院院感科出示的细菌药敏检测报告，院内感染目前最常见的病原菌为：铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯菌，金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及大肠杆菌。（按顺序，标本以痰液、分泌物以及血液为主） 物理性能测试： 力学性能测试：将干态和湿态的样品按GB/T634-1996切成标准样条，在美国Instron5567万能力学试验机上测定试样的拉伸强度。 吸水率的测试、相对保湿率的测试：参照文献[1]。 透气率的测试：参照文献[2]。 孔隙形貌观察：将试样充分干燥后，在扫描电镜上观察海绵的孔隙结构，加速电压为10 kV。 表面形貌测试：扫描电镜测定（包括细菌被破坏前和破坏后的形态） 细胞毒性测试： 1、以成纤维细胞测试 方法一：选用L929小鼠成纤维细胞进行毒性试验：设置空白组，对照组，实验组。37 ℃下，将材料分别浸没在培养基中过夜，种植细胞浓度为2.5×109 L-1的L929细胞20 μL(达到5×104细胞/孔)，平行数为5，分别培养1，3，7，14 d后将培养基小心地从培养板移除。用PBS冲洗3遍，每个孔加入 400 μL的培养基，然后在无光下再添加100 μL的5 g/L的MTT/PBS溶液。用铝箔将培养板裹紧，37 ℃下孵化4 h；用移液管移除培养基和MTT，每个孔添加200 μL二甲基亚砜，混合几分钟；从每个孔移除100 μL混合液，加入96孔板中；在490 nm波长下，用ELISA对孔板的溶液进行检测，记录吸光度值。 方法二：选用L929小鼠成纤维细胞进行体外细胞毒性实验：细胞培养、传代与计数：传代培养48 h后，弃去培养液，在生长旺盛的L929细胞加入0.25% 胰蛋白酶(pH 7.8) 液于37 ℃ 消化2.0~3.0 min，弃去消化液，加入RPMI 1640液以吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制备成6×107 L-1浓度细胞悬液。细胞形态观察及分析标准：将空白组（RPMI 1640培养液），实验组，对照组(6.4%苯酚溶液)各3 mL，分别置于35 mm细胞培养皿内，加入6×107 L-1浓度L929细胞悬液3 mL， 置于37 ℃ 、体积分数为5%CO2、100%湿度的培养箱培养24 h及72 h，倒置相差显微镜观察细胞形态及生长情况，细胞形态分析标准如下： 注：MTT比色法：参照ISO 10993.5-2009进行。具体步骤：将浓度为6×107 L-1的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μL，置于37 ℃、含体积分数为5%CO2培养箱内培养24 h，观察细胞贴壁后弃原液，用PBS洗涤2次。将3板随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组，实验组加入受试材料浸提液，空白组（RPMI 1640培养液），实验组，对照组(6.4%苯酚溶液)，每组10孔，每孔均为100 μL。将处理后的96孔板置于37 ℃、含体积分数为5%CO2培养箱中培养24，48，72 h。于各观察点末期弃原培养液，加入20 μL MTT(质量浓度为5 g/L)，37 ℃、含体积分数为5%CO2孵育4 h后终止培养。吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜100 μL，600 r/min振荡10 min，用酶标仪在490 nm测定吸光度(A)值，记录结果。计算相对增殖率(relative growthrate，RGR)。进行显著性分析：采用SPSS 13.0软件完成统计处理，实验数据以x_±s表示，P 0.05为差异有显著性意义。 3、以小鼠红细胞测试：即体外溶血试验 材料：家兔/小鼠、离心机、水浴锅、试管、离心管、蒸馏水、生理盐水，供试材料。 试验过程： 取家兔1只自耳静脉采血（或心脏采血）10ml，置放有玻璃珠的三角瓶中，轻微搅拌去除纤维蛋白。 将血移入有5-10ml生理盐水的离心管中，混匀后2500 r/min离心5min，弃去上清液，如此方法用生理盐水反复洗3-4次至上清液呈无色透明为止。 将洗涤好的红细胞用生理盐水配制成2%的红细胞悬液，备用。 结果判断：全溶血：溶液澄明红色，管底无红细胞残留；部分溶血：溶液澄明或棕色，管底有少量红细胞残留；无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明；凝集：不溶血，红细胞在试管底部凝集，振摇后细胞不能分散。 以小鼠淋巴细胞（有核细胞）测试： 取小鼠脾脏细胞根据功能和表面标志物分选出T/B淋巴细胞（cytotoxic CD8+ T cells、cytotoxic CD8+ T cells） in vitro：样品材料与小鼠血样配制100 mg/mL进行体外培养，培养方式基本同成纤维细胞，以流式细胞仪分选小鼠脾内淋巴细胞并计数。
in vivo：按10 mg/kg给予小鼠血静脉注射样品溶液，以流式细胞仪分选小鼠脾内淋巴细胞并计数 5、动物实验测定炎性反应： 样品如制成导管类（如导尿管、深静脉置