绿茶对s180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响.doc

医学免疫学试验设计 绿茶对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响 [摘 要] 目的：探讨绿茶对S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用以及对其免疫功能的影响。方法：将接种S180细胞的小鼠分成生理盐水正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺对照组和三个不同浓度的绿茶实验组，通过对肿瘤组织称重来比较各组肿瘤生长情况，通过制备脾细胞悬液并进行ConA诱导脾细胞增值反应分析绿茶对淋巴细胞增生的影响，通过对脾细胞悬液用10%小牛血清的RP-MI1640培养来分析绿茶对IL-2的生成及NK细胞活性的影响。 [关键词]：绿茶；荷瘤小鼠；IL-2；NK细胞活性；免疫功能 绿茶是历史上最早的茶类,也是我国茶量最大的茶类,在国际市场上,我国绿茶占国际贸易量的70%以上,销量遍及北非、西非各国及法、美、阿富汗等 50多个国家和地区。联合国卫生组织颁布的“世界六大种保健饮品”依次是：第一绿茶、第二红葡萄酒、第三豆浆、第四酸奶、第五蘑菇汤、第六骨头汤。绿茶为六大保健饮品之首，被誉为“世界第一大种保健饮品”。绿茶有益健康[1]是自古以来人们普遍认同的一种养生之道,随着生活水平的提高,人们越来越注重生活质量,具有养生作用的绿茶也越来越受欢迎。 近年来，恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，并且国内外对肿瘤的治疗及愈后较差，其原因可能是患者的免疫功能显著下降[2]。很多资料建议在治疗期间饮用绿茶来增强机体抵抗力，临床上应用绿茶多酚化合物以防癌的优点有：也经大量动物实验证明其有效性；无严重之副作用等[3]，本组对此很感兴趣，本研究旨在验证此种说法。 1 材料与方法 1.1主要试剂 绿茶，刀豆蛋白A（ConA），环磷酰胺。 1.2瘤源和细胞株 S180细胞和TAC-1细胞，P815细胞和CTLL-2细胞。 1.3实验动物分组 将昆明小鼠随机分为6组，即正常盐水对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺对照组和三个绿茶实验组，每组10只小鼠，后五组小鼠于右腋皮下接种S180细胞（每只2×106）。每日3个实验组开始经腹腔注射绿茶溶液，剂量分别为10，30,50mg/kg，荷瘤对照组注射等量生理盐水0.2ml，环磷酰胺对照组注射环磷酰胺20mg/kg 。每日1次，连续14天后处死小鼠取实体瘤称重，同时取脾细胞测定增值反应，IL-2长生能力，NK细胞活性。 1.4试验方法 1.4.1测肿瘤抑制率 停药后处死小鼠，剥离完整肿瘤组织，电子天平称量瘤体湿重（精确到0.001）并计算肿瘤生长抑制率。抑制率（﹪）=（荷瘤对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/荷瘤对照组平均瘤重×100﹪。肿瘤组动物平均质量1表示肿瘤生长不良，实验组小鼠死亡率20﹪表示药物所致毒性。 1.4.2小鼠脾细胞悬液的制备 将小鼠处死，取脾脏，研磨，沙网过滤(200目)，加入红细胞裂解液裂解3分钟，1500r/min离心8分钟，取出淋巴细胞，生理盐水冲洗2次，800r/min离心10分钟，RP-MI1640培养液调细胞浓度为5×106ml-1,37℃ 5%CO2饱和湿度培养，备用。 1.4.3 ConA诱导的脾细胞增值反应 采用常规H-TdR掺入法。将制备的小鼠脾细胞悬液用RP-MI1640培养液制成2×107ml-1细胞悬液，每孔1ml分装到24孔培养板中，每孔加入ConA3μg于CO2培养箱37℃孵育56小时后，加入3H-TdR达到终浓度37KBq/ml后继续置CO2培养箱37℃孵育16小时后，将各孔细胞收集到玻璃纤维纸上，置于FJ-2100型液体闪烁计数器测定并计算dpm值。 1.4.4 IL-2的诱生和活性测定 将制备的小鼠脾细胞悬液用含10%小牛血清的RP-MI1640培养液调整浓度为5×106ml-1，接种于24孔培养板，每孔500ml，每孔再加入终浓度5μg/ml的ConA，500μg/孔，37℃ 5%CO2培养箱没培养24小时后离心取上清，备用。取传代培养48小时的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用含10%小牛血清的RP-MI1640培养液调整浓度为1×106ml-1，接种于96孔培养板100μl /孔，同时将待测样品也加入培养板100μl /孔，置于CO2培养箱37℃孵育56小时后，加入3H-TdR达到终浓度37KBq/ml后继续置CO2培养箱37℃孵育16小时后，将各孔细胞收集到玻璃纤维纸上，置于FJ-2100型液体闪烁计数器测定并计算dpm值。 1.4.5 NK细胞活性测定 将制备的小鼠脾细胞悬液用含10%小牛血清的RP-MI1640培养液调整浓度为5×106ml-1于96孔培养板，每孔中分别加入100μg脾细胞悬液和YAC-1细胞，靶细胞（YAC-1细胞，浓度1×105个/ml，效靶比值50:11，设靶细胞自然释放组和最大释放对照组（YAC-1细