细胞的传代培养与冻存.docxVIP

实验4、细胞的传代培养与冻存【实验目的】1.掌握无菌操作技术。 2.掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。 3.掌握培养细胞的消化方法。 4.了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。【实验原理】1.细胞系（Cell Line）与细胞株（Cell Strain)的概念细胞系： 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞， 即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性- 恶性转化细胞 transformed cell Line细胞株（Cell Strain）：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞繁殖形成的细胞群，具有特殊性质或标志物。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群亦可称2. 传代培养的概念体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，进行下一步的实验并维持细胞种的延续。当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。 所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间（细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称为传代，进行一次分离再培养称之为传一代），如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。 为亚株（substrain）。3.贴壁型细胞与悬浮型细胞 贴壁型细胞： 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 圆形的细胞-----贴壁----铺展----有丝分裂----对数生长期。----致密的细胞单层，叫做单层细胞（单层细胞培养）. ----表面相互接触时，就停止分裂增殖。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 半悬浮生长细胞传代：此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。4. 什么时候传代？一般生长稳定的细胞2～3天或4 ～ 5天传代一次。5.传代方法悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀，分别加入到几个培养瓶中，补充完全培养基。 直接传代法：用吸管直接轻轻吹打细胞悬液，将细胞悬液分别转移到几个培养瓶中，补充完全培养基。 半悬浮生长细胞传代 此类细胞贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。6.细胞冻存在低于-70℃的超低温条件下，由机体内部的生化反应极其缓慢，甚至终止，因此采用适当的方法将生物材料降至超低温条件，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物体恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。 冷冻保存就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保存液的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其进行长期保存的过程。 水在低于零度的条件下→结冰→细胞死亡 如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。最适冷冻速度：不同细胞的最适冷冻速度不同。标准冷冻的开始速度为－1至－2度/min，当温度低于－25度时，可加速，到－80度时可直接加入液氮中（－196度）。复苏细胞时则直接将细胞的冻存管放到40度热水中迅速解冻。 通常采用4度10分→ –20度30分→ –80度过夜→液氮罐 （或棉花包好细胞-80过夜→液氮罐）【实验仪器、材料、试剂及用品】一．仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜二．材料：细胞 人宫颈癌HeLa 细胞 人胃癌BGC-823细胞三．试剂：胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素四．用品：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯【实验步骤】1.准备：超净工作台紫外线处理30分钟, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。 2. 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置室温下预热。3．关闭超净台紫外灯, 打开可见光灯开关,打开抽风机清洁空气，除去臭氧。用75%酒精擦双手消毒 。 4.正确摆放超净台内的实验用品：酒精灯、酒精棉球、