细胞工程基础实验技术(细胞育种)教案.docVIP

实验1 细胞工程基础实验技术 实验准备：MS培养基母液配制按配方表配制MS培养基母液：大量元素配20×，微量元素和其它成分配制成200×，母液贮存于2～4℃的冰箱中。 植物激素配制BA和NAA配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。 1.1 实验目的使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。 1.2 实验用品及溶液实验按每4个学生一组，每组分发培养基母液及激素母液一套，50ml量筒、1000ml有刻度烧杯、吸球、电炉各1 个，5ml移液管9支，50ml三角瓶20个。公用设备：pH计，高压灭菌锅。 1.3 操作方法实验按500ml容量一组配制培养基，保证下一次实验每一学生有5瓶培养基供接种用。愈伤组织诱导培养基：MS＋BA 2mgl-1+NAA mgl-1+ Sucrose 20g-1+ Agar 7g-1A．向容量瓶中顺序加入培养基母液：大量元素 25ml微量元素 2.5ml铁 盐 2.5ml其它成分 各2.5mlBA和NAA 各2.0mlB．加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水，加入10g蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。C．加入3.5g琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积500ml，继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。用记号笔写上学号或姓名。D. 分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力1.1kg/cm2，灭菌时间20min.左右。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。 1.4 记载内容培养基配制过程。 灭菌方法介绍不同类型灭菌设备的使用方法；采用高压蒸汽灭菌器对配置的培养基进行灭菌。 实验2 无菌操作及愈伤组织诱导技术 实验准备：烟草无菌试管苗培养：将烟草种子用消毒液84＃消毒后，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干水分，接种在MS培养基上。种子苗具4-5叶时继代扩繁90盒，保证每学生1盒。无菌培养皿每学生2套。实验课开始前30min. 将实验用具、培养基及无菌烟草苗同时用酒精用75%酒精擦洗后置于超净工作台，打开超净工作台风机和紫外灯。 2.1 实验目的掌握无菌操作技术；基本掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件。 2.2实验材料及设备外植体材料：烟草无菌苗叶片；实验1配制的培养基。设备及工具：超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等；75%酒精。 2.3 操作方法A. 在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。B. 点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。C. 取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，一般每瓶接种4-5小片。D. 快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。E. 接种后的三角瓶置于24℃，条件下黑暗培养一周，然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养直至愈伤组织形成。注意外植体切割时，动作要快，否则会造成失水而影响生长。为防止操作时失水也可在培养皿中滴几滴无菌水，然后将无菌苗置于其中进行切割。 2.4 记载内容培养基凝固状况；实验操作过程；叶片生长状况、接种外植体大小；每瓶接种数、接种总瓶数。 实验3 器官发生与植株再生调控培养；愈伤组织增殖培养 实验准备：配制器官分化和愈伤组织诱导培养基。培养基配方：分化培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和0.5mgl-1NAA。愈伤组织增殖培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和2.0mgl-1NAA。 3.1 实验目的观察和分析不同光照条件形成的愈伤组织对器官分化的影响，观察和分析愈伤组织诱导和器官分化的激素使用差异；了解器官分化和植株再生的过程。掌握离体培养中的转接技术。 3.2 实验材料及设备实验材料：实验2中诱导的愈伤组织实验设备和用具：同实验2。 3.3 操作方法A. 观察实验1愈伤组织诱导结果：统计愈伤组织诱导率；观察记载黑暗和光照条件下愈伤组织的差异，结合理论学习进行分析。愈伤组织形成率＝愈伤组织数/接种外植体数B. 按照实验2相同的步骤，作好无菌操作准备。C. 将实验2中光照下诱导的愈伤组织，全部转入分化培养基上，黑暗诱导的愈伤组织一半转入分化培养基，所有转入分化培养基的愈伤组织均置于连续光照或16h/d光照，温度20－22℃条件下培养。需要注意的是，愈伤组织的状态常常受许多因素的影响，如果转入分化培养后3－4周仍然没有芽的形成，或愈伤组织状态没有明显变化，应及时调整培养基激素浓度，更换新鲜培养基。D.