细胞基质的质量控制.docxVIP

发布日目生物制品评价生物制品质量控制标题细胞基质的质量控制作者审评二部部门正文内容细胞基质的质量控制?大多数现行疫苗是通过组织培养的方法制备的，所谓组织培养是体外培养一定量的动物细胞并接种病毒，利用病毒在细胞内增殖，得到预期的病毒抗原，然后制成疫苗。?众所周知，疫苗的质量控制是全面的质量控制，包括原材料、生产过程、半成品、成品，细胞基质是疫苗生产的主要原材料，其质量控制直接影响终产品的安全性。本文简要介绍WHO对细胞基质质量控制的要求。?一、细胞基质的种类?1.原代细胞：动物组织经胰酶消化培养成单层细胞，用于病毒的培养。如地鼠肾细胞、沙鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞等。在疫苗的生产中使用了40多年，证明是安全有效的。?优点：1）相对简单；2）具有广泛的敏感性。?缺点：1）有较严重的潜在的病毒污染问题，动物的级别很难达到SPF级；2）来自不同动物的质量和敏感性有差异；3）动物来源越来越困难，尤其是灵长目动物。?2.二倍体细胞：具有一定的传代寿命，超过一定代次，细胞衰老。如2BS细胞、MRC-5细胞等。在疫苗的生产中使用了30多年，证明是安全有效的。?优点：1）能够充分鉴定和标准化；2）使用种子库系统生产。?缺点：1）不易大规模生产，尤其是不能微载体生物反应器。2）对培养基及牛血清的要求较高。?3.传代细胞：理论上具有无限传代的寿命。如Vero细胞、BHK21细胞等。?优点：1）能够充分鉴定和标准化；2）使用种子库系统生产。?3）可大规模生产，可用于微载体生物反应器。4）对培养基及牛血清的要求不高。?缺点：理论上有致肿瘤性的危险。但已证明Vero细胞在134~150范围内使用，无致肿瘤性。?二、动物细胞的潜在危险?1.病毒污染：?1）人类或灵长目动物细胞可能携带潜在病毒，如乙型肝炎病毒、逆转录病毒等。?2）禽类组织细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒，?3）啮齿类细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒，?2.细胞DNA?l原代细胞和二倍体细胞的残余DNA无危险性。?l传代细胞系的DNA具有是其他细胞生长失控和产生致肿瘤活性的潜在能力。并认为＜10ng/剂量是安全的。?3.促生长蛋白?生产细胞可分泌生长因子，认为不构成严重危险。但使用传代细胞生产的疫苗，应进行纯化，去除细胞蛋白。?三、WHO的有关要求?（一）对所有生产细胞的要求?1.GMP?1）规范的操作；?2）原材料的选择，细胞的供体应无传染病或病因不能确定的疾病。?2.细胞培养中的有关检测?1）牛血清：无细菌、真菌、支原体和感染性病毒。有些国家还要进行无噬菌体的检测；有些国家使用辐射的方法灭活潜在污染的病毒。用TSE非疫区的牛血清。?2）胰酶：无细菌、真菌、支原体和感染性病毒，特别进行牛或猪细小病毒的检测；有些国家使用辐射的方法灭活潜在污染的病毒。?3）生产结束时的检测：无细菌、真菌、支原体。?4）生产结束时检测外源性病毒。?（1）25%的对照细胞（不接种病毒）无病变；（2）豚鼠红细胞血吸附法检测阴性；（3）转种人二倍体细胞、本细胞系的其他批次、其他种属的细胞系无病变并血吸附阴性。?（二）对传代细胞的要求?1.建立主代细胞库、工作细胞库?对于主代细胞库须进行一次全面的外源因子检定，检测可能存在的内源性和外源性外源因子，特别注意已知以潜伏状态存在于来源物种中的因子。主代种子库检定合格后，工作种子库和生产细胞只进行一般的外源因子检查。?l无菌试验（细菌、霉菌、支原体）?l细胞法检测病毒外源因子：至少用107细胞转种人二倍体细胞、本细胞系的其他批次、其他种属的细胞系，无病变并血吸附阴性。?l用动物和鸡蛋检测病毒因子：?1）乳鼠2窝（每窝至少10只），脑内、腹腔注射。?2）成鼠10只，15~20克，脑内、腹腔注射。?3）豚鼠5只，350~450克，腹腔注射?4）家兔5只，1.5~2.5kg，皮下注射?5）鸡胚10只，9~11日龄，尿腔囊。?6）鸡胚10只，5~6日龄，卵黄囊。?以上每组接种待检细胞数量不少于107个，动物观察至少4周，鸡胚至少观察5天，应键存。?l逆转录病毒的检测：一般用高敏感性的细胞扩增待检细胞培养物中的逆转录病毒，然后进行检测。?1）感染性检测?2）透射电镜检测?3）逆转录酶分析?l致肿瘤性检测?动物：1）裸鼠；2）新生小鼠或大鼠经抗胸腺血清处理；3）无胸腺小鼠。?每只动物皮下注射107细胞，以Hela细胞（106 ）作阳性对照，有结节的观察1~2周，解剖做病理检查。无结节的，一半观察21天，另一半观察12周，解剖做病理检?查，应为阴性。?（三）二倍体细胞?除要传代细胞的检测项目外，增加细胞染色体分析。?检测200个分裂中期的细胞，计算染色体数目，检测超二倍体、亚二倍体、多倍体、断裂和结构异常的比例。?四、小结?细胞基质在疫苗生产中必不可少，其质量