PCR反应及琼脂糖电泳实验报告.docVIP

多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测 一、实验目的： 1、了解PCR技术的基本操作 2、理解PCR的原理 3、讨论PCR的应用 二、实验原理： PCR是一种在体迅速扩增DNA片段的技术，这一技术 参与的组分 在DNA复制中的作用 实验条件/材料 模板 DNA的两条单链 提供复制的模板 模板DNA 原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 dNTP mixture 酶 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 Taq DNA 聚合酶 酶 解旋酶 打开DNA双链 温度控制 引物 一小段单链DNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点 引物I 引物II 此外，试验中用到的还有Mgcl2，Mg2+能激活酶的活性；10* Buffer 缓冲液，为Taq酶提供合适的PH条件。 2、PCR反应条件 PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。 (!)变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。 (2)复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 (3)延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。 循环数 变性 复性 延伸 第一次（预变性） 94°C，30s － － 30次 94℃，20s 52℃，20s 72℃，20s 最后一次（保温） 72℃，30s 3、PCR产物的检测I 和引物II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水（ddH2O），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。 (2)向装有Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分： 10x Buffer 50 μL MgCl2 50 μL dNTP mixture 20μL 上游引物(引物I) 25μL 下游引物(引物II) 25 μL 模板DNA 25 μL ddH2O 290μL 原有的Taq DNA 聚合酶有15ul，此时混合液体系共计500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行） (3)共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于0.5ml的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。 (4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCR仪上进行DNA扩增。 2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA （1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。 （2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶。在锥形瓶中，称取的琼脂糖粉，加入，在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60 ℃，倒入电泳槽中，待其凝固。（3）小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。向电泳槽中缓缓倒入电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。 （5（6）（6）接通电源电压为 V，电流最大。 （7）当指示剂移动到凝胶时，断开电源，终止电泳。 （8）电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。