pcr条件选择.docVIP

首先要看你的条带是否清晰，虽然亮度不够但是清晰度应该高，没有拖尾没有非特异条带和引物二聚体，如果以上都没有，仅仅是目标条带不够亮的话，我觉得 你可以将25微升体积同比放大至50微升反应体系，相应的制胶的时候插孔槽用大梳子而不是小的那种。还有很重要的就是你的核酸染料是什么？我用过几种核酸染料感觉还是EB亮度最好，虽然毒性大了点。如果条带不够亮，还有拖尾、非特异条带、引物二聚体等问题，那就是你反应体系中需要优化。1、出现非特异扩增可能是你的引物设计上特异性差或者引物浓度过高，Mg浓度或酶含量过高（适当改变Mg浓度从1mM到3mM，间隔0.5mM进行梯度试验，或者酶含量改变按0.5U为间隔梯度试验。）2、如果出现拖尾，，要考虑引物特异性和模板纯度，另外循环数、退火温度以及Mg含量过高、dNTP过多等也可能造成拖尾。 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95变性，再迅速冷却至40 ～60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因长度为100～300bp时可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性。　　变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93～94lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。　　退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40～60，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　　　　Tm值解链温度=4G+C＋2A+T　　　　　复性温度=Tm值-5～10　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 　　延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　　　　　　　　70～80 150核苷酸/S/酶分子　　　　　　　　　70 60核苷酸/S/酶分子　　　　　　　　　55 24核苷酸/S/酶分子　　　　　　　　　高于90时， DNA合成几乎不能进行。　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 　　循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 ① 引物长度 一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃ ? 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。 ? 总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。 ? ② GC含量 一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。 ? ③ 退火温度 退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低