SRAP-RAPD实验操作流程.docVIP

SRAP-RAPD实验操作流程 1酶类及试剂 Taq DNA聚合酶为大连宝生物工程公司产品； 蛋白酶K为Merk公司产品； T4DNA连接酶为Promega公司产品。 Wizard DNA Clean-up System、WizardTM PCR Preps DNA Purification System为Promega公司产品；小量基因组DNA抽提试剂盒、UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒为上海生物工程公司产品。 DL-2000 DNA Size marker为大连宝生物工程公司产品，100bp DNA Size marker由广州普博馈赠。 2培养基 LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加800mL去离子水充分溶解，用1mol/L的氢氧化钠溶液调整pH为7.2~7.4，加去离子水定容至1000mL，分装后15磅高压蒸汽灭菌15~20min，4℃保存备用。 LB固体培养基：于LB液体培养基中加1.6%的琼脂粉，15磅高压蒸汽灭菌15~20min，待其冷却至70℃左右时倒板，凝固后4℃保存备用。 LB选择培养基：在LB液体培养基中加1.6%的琼脂粉，15磅高压蒸汽灭菌15~20min，待其冷却至50℃左右时，加入氨苄青霉素（Amp）（终浓度1000IU/ mL）轻轻摇动使其混合均匀，迅速分装至无菌平皿，室温凝固后4℃保存备用。 按分子克隆实验指南（第三版）（萨姆布鲁克等，2002）介绍的方法进行。 （1）Tris-Cl（pH8.0） Tris碱 121.1g 浓盐酸 42mL 加去离子水定容至1000mL （2）TE缓冲液（pH8.0） 10mol/L Tris-Cl（pH8.0） 1μL 0.5M EDTA（pH8.0） 0.2μL 加无菌去离子水定容至100ml，混匀，分装后经高压灭菌，4℃保存。 （3）5×TBE缓冲液 Tris 54g 硼酸 27.5g EDTA 3.72g 加去离子水定容至1000mL （4）10×TBE缓冲液 Tris 54g 硼酸 27.5g EDTA（0.25mol/L） 80μL 加去离子水定容至500mL （5）X-gal液（20mg/mL） X-gal 0.08g 二甲基甲酰胺 4mL 充分溶解混匀，分装于1.5mL灭菌消毒的Eppendorf管中，用锡箔纸包裹以避光，-20℃保存。 （6）IPTG液 IPTG 0.6g 去离子水 3mL 充分溶解混匀，用0.25μm孔径的细菌滤器过滤，分装于1.5mL灭菌消毒的Eppendorf管中，-20℃保存。 （7）SDS裂解液 500mM NaCl 70μL 100mM Tris-Cl（pH8.0） 30μL 50mM EDTA（pH8.0） 150μL 10%SDS 30μL （8）70%乙醇 无水乙醇 30ml 灭菌双蒸水 70ml （9）封底用1%琼脂糖 琼脂糖 1g 去离子水 100ml （10）40%丙烯酰胺液 丙烯酰胺 38g Bis 2g 去离子水 100ml 装于棕色瓶中，4℃保存。 （11）10%AMP 过硫酸铵 1g 去离子水 10ml （12）0.1%银染液 硝酸银 0.5g 去离子水 500ml 装于棕色瓶中，室温保存。 （13）显影液 NaOH 15g 硼酸