人工细胞膜上天然酶与人工受体的分子间通讯 (修复的).docxVIP

内源性一氧化氮合酶抑制物与内皮细胞通讯功能障碍及（口山）酮的保护作用动脉粥样硬化(AS)是冠心病发病的主要原因，目前研究认为血管内皮受损在AS发生发展中起关键作用。一氧化氮(NO)主要由NO合酶(NOS)催化L-精氨酸转化而来，在维持血管结构和功能中起重要作用，被认为是一个关键的内源性抗AS分子。 近期研究发现，体内存在内源性NOS抑制物非对称二甲基精氨酸(ADMA)，能减少NO合成，进而损伤内皮功能。ADMA还能诱导氧化应激和炎症因子生成，促进内皮损伤等，可能是一个新的内源性致AS分子。二甲基精氨酸一二甲胺水解酶(DDAH)是ADMA的代谢酶，其活性下降是体内ADMA累积的主要原因。抗氧化药维生素E、普罗布考等的抗AS作用与增加DDAH活性，降低ADMA水平有关，提示DDAH/ADMA通路可能是AS防治的新靶点。 本论文在细胞和动物水平系统探讨了ADMA致内皮功能不全的作用机制、DDAH/ADMA通路在AS形成和防治中的作用及抗氧化药物口山酮的抗AS作用。 第一章ADMA促动脉粥样硬化作用的研究 第一节ADMA促动脉粥样硬化形成的作用研究背景研究显示，间隙连接通讯(CJIC)功能改变在AS发病机制中具有一定意义。GJ由细胞质膜上的蛋白质亚单位—间隙连接蛋白(Cxs)相互衔接而成。血管内皮的自稳态及生理功能的维持，都依赖于内皮GJIC介导的信息交换和协同反应。研究表明，Cx43的表达、空间分布及结构变化以及其引起的GJIC功能变化可能在AS发病机制中具有一定意义。对内皮细胞GJIC功能和Cx43表达的影响是多种AS危险因素致内皮功能不全的机制。 大量研究表明，多种因素均可通过增加细胞内氧自由基生成，氧化Cx或者改变其所在膜环境诱发Cx构象改变，导致GJIC功能障碍。基于氧化应激是导致GJIC功能障碍的重要原因以及内源性ADMA能诱发氧化应激，推测ADMA可能通过致氧化作用氧化Cx43导致GJIC功能障碍，进而促进AS发生发展。 方法:实验设4组(n=8)：①野生型C57BL/6J小鼠组；②野生型C57BL/6J小鼠外源性ADMA处理组；@ApoE基因缺陷(ApoE-/-)小鼠组；④ApoE-/-小鼠外源性ADMA处理组。ADMA(5 mg/kg)每日皮下注射。4周后，眼眶取血，离心，分离血浆，检测血浆对氧磷酶(PON1)活性、ADMA(HPLC法)浓度；开胸，迅速分离主动脉，观察动脉粥样损伤(苏丹红染色法)及主动脉内皮Cx43蛋白表达(免疫组化法)。 结论:ADMA是AS形成的重要促进物，其作用可能与下调内皮细胞Cx43表达，进而抑制间隙连接细胞间通讯功能有关。 第二节 NADPH氧化酶介导溶血性磷脂酰胆碱诱发的ADMA升高 背景:内皮功能紊乱与氧化应激密切相关。活性氧(ROS)在氧化应激中起重要作用。NADPH氧化酶途径是内皮细胞活性氧的重要来源。研究表明，内皮细胞增殖及凋亡，缺氧/复氧损伤和NO介导的内皮舒张功能障碍均涉及NADPH氧化酶活性变化。 ADMA与血管内皮功能密切相关。多种刺激因素包括氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)均可诱导ADMA生成。已知溶血性磷脂酰胆碱(LPC)是ox-LDL的主要成分，能诱导ADMA生成，并能激活NADPH氧化酶诱发氧化应激。因此，本实验探讨了LPC诱导的ADMA升高是否通过NADPH氧化酶途径诱发氧化应激，进而影响ADMA代谢酶活性而发挥作用。 方法:将人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12)分为：正常对照组；LPC(10mgm)损伤组；LPC+NADPH氧化酶抑制剂DPI(100和300 μM)组；LPC+黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇(100μM)组。LPC处理前1 h加入药物，细胞培养相应时间后，收集细胞，提取蛋白，检测PRMTI表达(Western blot)、DDAH活性(HPLC法)及细胞内ROS水平(荧光法)；收集细胞培养液，测定NO(Griess法)和ADMA(HPLC法)浓度；MTT法检测细胞活性。 结论:LPC诱发ADMA水平增高与其升高NADPH氧化酶活性，进而上调PRMT表达及降低DDAH活性有关。 第三节 ADMA对细胞通讯功能的影响 背景:内皮细胞功能完整性的维持需要各个细胞间活动的高度协调，GJIC在其中发挥重要作用。在人脐静脉内皮细胞主要表达Cx43。研究发现，AS发生发展与内皮细胞间GJIC功能缺陷密切相关，Cx43的表达、空间分布以及结构变化对AS具有重要调控作用。 LDL是促进AS斑块发生的主要脂质成分，可诱发内皮细胞功能和结构的改变。LDL所诱发的内皮功能不全中，ADMA起重要介导作用。研究发现，LDL所致内皮细胞问GJIC功能改变可能是其致AS的重要机制之一。本实验在细胞水平观察了LPC对内皮细胞GJIC功能和Cx43表达的影响。体内90％以上ADM