柱前衍生RP-HPLC法测定胸腺五肽的氨基酸组成.pdfVIP

承 德 医 学 院 学 报 VO1．32 No．4 2015 柱前衍生RP．HPLC法测定胸腺五肽的氨基酸组成 李松涛 (河北省中药研究与开发重点实验室／承德医学院中药研究所，河北承德 067000) 【关键词】氨基酸；胸腺五肽；柱前衍生；异硫氰酸苯酯；高效液相色谱法 【中图分类号】Q517 【文献标识码】A 【文章编号】lOO4．6879(2o15)o4-0327．02 胸腺五肽(th_ymo~ _，TP5)是人工合成的五肽，对 对照品各l0 mol，用0．1mol／L的盐酸溶液定容至10rnl， 应胸腺生成素 Ⅱ的32-36位氨基酸，基本序列~ I2-Ax,g- 配制溶度为lt．tmol／ml的氨基酸混合对照品溶液，4℃冰 Lys-Asp-Val-Tyr-COOH，它保留了胸腺生成素的有效生物 箱储存备用。 活性。TP5是一种免疫调节剂，对机体免疫功能具有双向 2．1．2 TP5水解液的制备：准确称取TP5(10mg)于20ml 调节作用，在临床上主要用于治疗原发性和继发性免疫 安瓿管中，加入6mol／L的盐酸溶液(含0．2％苯酚)10ml 缺陷，也可用作各种恶性肿瘤的辅助用药 。 后真空烧结封口，放置在干燥箱内ll0℃下水解24h后取 由于1]P5具有广泛的生物活性，并能有效应用于临 出、冷却。取2ml水解液至10ml容量瓶 中，加水定容，摇 床，市场需求量逐年扩增。氨基酸组成分析作为合成多 匀。离心后取1Inl上清液，冷冻干燥，再加入0．1mol／L的 肽结构确证与质量评价方法之一，是多肽生产过程中的 盐酸溶液lml溶解，4℃冰箱储存备用。 一 项重要环节。本研究采用我实验室建立的氨基酸组成 2．1．3 柱前衍生化：精密量取氨基酸混合对照品溶液、 分析方法—柱前衍生RP—HPLC法 对多肽原料药TP5 TP5水解液200 l，分别加入0．1mol／L的PrrC乙腈溶 的氨基酸组成进行测定，为该方法的实际应用提供实验 液(0．12mlP1TC用乙腈定容至lOml，摇匀即得)和lmol／ 依据。 L的三乙胺乙腈溶液(1．35ml三乙胺用乙腈定容至10ml， 1仪器与试剂 摇匀即得)各100~l，摇匀后室温静置1h，加入正己烷400 LC98-IAAA氨基酸分析仪、二元梯度泵、柱温箱、 山，充分振摇，静置lOmm，弃去上层溶液，再加入正己烷 在线真空脱气机、紫外检测器(北京温分分析仪器技术开 萃取一次，吸取下层溶液100 l，用超纯水稀释5倍，过 发有限公司)；浙大智达N2000色谱数据工作站；电热鼓 0．45um微孔滤膜，取续滤液进样l0ul。 风干燥箱(上海博迅实业有限公司)；纯水器(力康生物医 2．2 色谱分析 色谱分析条件及方法学考察参见本实验 疗科技控股有限公司)；TDL40B型台式离心机(上海安亭 室已建立的氨基酸测定方法一柱前衍生RP删 C法 ，5 科学仪器厂)；LG卜18型冷冻干燥机(北京松源华兴科技 种氨基酸对照品和Ⅱ)5水解液的HPL结果见附图。 有限公司)；PHS--3C型酸度计 海佑科仪器仪表有限 2．3 回收率试验 精密称取6份已知氨基酸含量的Ⅱ)5 公司)；电子分析天平(奥豪斯仪器上海有限公司)。 (1Omg)，按 2“．1．2”项下方法制备1’P5水解液，分别加入 天冬氨酸(Asp)、精氨~(Arg)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸 一 定量氨基酸对照品溶液，经衍生化后进样测定，计算回 (Va1)、赖氨酸 (Lys)对照品(中国药品生物制品检定所)； 收率。5种氨基酸的平均回收率为9