工作液储存期验证.doc

工作菌液贮存时间验证方案 1．目的： 确认工作菌液在2-8℃条件下的贮存时间。 2．范围：适用于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的工作菌液贮存。 3．环境条件要求：所有检查在环境洁净度10000级下的局部100级洁净度的单向流空气区域隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物再污染。 4．验证方法的依据：《中国药典》2010年版二部。 5．验证前准备： 5.1验证用菌种 金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104] 大肠埃希菌[CMCC(B) 44102] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] 生孢梭菌[CMCC(B) 64941] 白色念珠菌[CMCC(F) 98001] 黑曲霉[CMCC(F) 98003] 5.2培养基的制备： 营养肉汤培养基 批号： 北京三药科技开发公司 硫乙醇酸盐流体培养基 批号： 北京三药科技开发公司 营养琼脂培养基 批号： 北京三药科技开发公司 改良马丁琼脂培养基 批号： 北京三药科技开发公司 改良马丁培养基 批号： 北京三药科技开发公司 玫瑰红钠琼脂培养基 批号： 北京三药科技开发公司 以上培养基按照说明书配制后灌装于洁净的容器中，加塞，按经过验证合格的灭菌程序进行灭菌，培养基的适用性检查应符合规定。 5.3稀释液的制备： 0.9％无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水溶解至1000ml，121℃灭菌20min。 0.05％聚山梨酯80无菌氯化钠溶液：取土温80 0.5ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至1000ml，121℃灭菌20min。 5.4菌原液制备： （1）将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物分别接种至营养肉汤培养基中，经30-35℃培养18-24 （2）将生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，经30-35℃培养18-24 （3）将白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，经23-28℃培养24-48小时。 实验人/日期： （4）接种黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，备用。 实验人/日期： 6.验证内容： 6.1菌种的确认 菌种名称 代数 编号 接种日期 实验人员 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉 6.2仪器设备： 实验中所用的玻璃仪器及金属器皿在使用前均经过170—180℃干热灭菌至少60分钟。 隔水式恒温培养箱： GRP—9050 型 北京桑翌科技发展有限公司 生化培养箱： SHP-250型 上海森信实验仪器有限公司 立式压力蒸汽灭菌器： LDZM—75 上海申安医疗器械厂 天平： DT系列电子天平 中国江苏常熟长青仪器仪表厂 电热鼓风干燥箱： 101-3AB型 天津泰斯特仪器有限公司 家用冰箱 6.3 验证过程 6.3.1新制备原菌液计数 （1）取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌的菌原液，用稀释液0.9％无菌氯化钠溶液，以十倍递增稀释法制备菌液，平皿法计数： 菌液名称 稀释度 稀释日期 计数（cfu/ml） 计数日期 实验人员 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉 （2）取黑曲霉孢子悬液，用稀释液0.05％聚山梨酯80无菌氯化钠溶液，以十倍递增稀释法制备菌液，平皿法计数： 菌液名称 稀释度 稀释日期 计数（cfu/ml） 计数日期 实验人员 黑曲霉 6.3.2保存条件的确认： 将上述原菌液及各稀释级别菌液包扎好后，置冰箱（2-8℃）保存，原菌液一定时间计数一次，计数方法严格同上，使操作带来的误差减少到最少。 6.3.3结果 金黄色葡萄球菌： 贮存天数 稀释度 稀释日期 计数（cfu