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工作液储存期验证
工作菌液贮存时间验证方案
1.目的:
确认工作菌液在2-8℃条件下的贮存时间。
2.范围:适用于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的工作菌液贮存。
3.环境条件要求:所有检查在环境洁净度10000级下的局部100级洁净度的单向流空气区域隔离系统内进行,其全过程严格遵守无菌操作,能防止微生物再污染。
4.验证方法的依据:《中国药典》2010年版二部。
5.验证前准备:
5.1验证用菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104]
大肠埃希菌[CMCC(B) 44102] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501]
生孢梭菌[CMCC(B) 64941] 白色念珠菌[CMCC(F) 98001]
黑曲霉[CMCC(F) 98003]
5.2培养基的制备:
营养肉汤培养基 批号: 北京三药科技开发公司
硫乙醇酸盐流体培养基 批号: 北京三药科技开发公司
营养琼脂培养基 批号: 北京三药科技开发公司
改良马丁琼脂培养基 批号: 北京三药科技开发公司
改良马丁培养基 批号: 北京三药科技开发公司
玫瑰红钠琼脂培养基 批号: 北京三药科技开发公司
以上培养基按照说明书配制后灌装于洁净的容器中,加塞,按经过验证合格的灭菌程序进行灭菌,培养基的适用性检查应符合规定。
5.3稀释液的制备:
0.9%无菌氯化钠溶液:取氯化钠9.0g,加水溶解至1000ml,121℃灭菌20min。
0.05%聚山梨酯80无菌氯化钠溶液:取土温80 0.5ml,加0.9%无菌氯化钠溶液至1000ml,121℃灭菌20min。
5.4菌原液制备:
(1)将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物分别接种至营养肉汤培养基中,经30-35℃培养18-24
(2)将生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基中,经30-35℃培养18-24
(3)将白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中,经23-28℃培养24-48小时。
实验人/日期:
(4)接种黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上,23~28℃培养5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,备用。 实验人/日期:
6.验证内容:
6.1菌种的确认
菌种名称
代数
编号
接种日期
实验人员
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌
生孢梭菌
白色念珠菌
黑曲霉
6.2仪器设备:
实验中所用的玻璃仪器及金属器皿在使用前均经过170—180℃干热灭菌至少60分钟。
隔水式恒温培养箱: GRP—9050 型 北京桑翌科技发展有限公司
生化培养箱: SHP-250型 上海森信实验仪器有限公司
立式压力蒸汽灭菌器: LDZM—75 上海申安医疗器械厂
天平: DT系列电子天平 中国江苏常熟长青仪器仪表厂
电热鼓风干燥箱: 101-3AB型 天津泰斯特仪器有限公司
家用冰箱
6.3 验证过程
6.3.1新制备原菌液计数
(1)取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌的菌原液,用稀释液0.9%无菌氯化钠溶液,以十倍递增稀释法制备菌液,平皿法计数:
菌液名称
稀释度
稀释日期
计数(cfu/ml)
计数日期
实验人员
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌
生孢梭菌
白色念珠菌
黑曲霉
(2)取黑曲霉孢子悬液,用稀释液0.05%聚山梨酯80无菌氯化钠溶液,以十倍递增稀释法制备菌液,平皿法计数:
菌液名称
稀释度
稀释日期
计数(cfu/ml)
计数日期
实验人员
黑曲霉
6.3.2保存条件的确认:
将上述原菌液及各稀释级别菌液包扎好后,置冰箱(2-8℃)保存,原菌液一定时间计数一次,计数方法严格同上,使操作带来的误差减少到最少。
6.3.3结果
金黄色葡萄球菌:
贮存天数
稀释度
稀释日期
计数(cfu
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