PCR反应中遇到几个常见问题和对策.docVIP

PCR反应中遇到的几个常见问题与对策 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 。 原因分析： 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 ?原因分析： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因分析： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因分析： 靶序列或扩增产物的交差污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。